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A balance shift between error-free and error-prone DNA double-strand break repair pathways as a novel mechanism of radiosensitization by nucleoside analogs

Magin, Simon

Achieving improvements in cancer therapy is one of the major challenges of contemporary medicine. Combining drug treatment and radiotherapy to achieve synergistic killing of cancer cells is one of the most promising current approaches towards this goal. Aim of this thesis was to elucidate mechanisms of radiosensitization by nucleoside analogs (NAs), a highly promising class of chemotherapeutics, using 9-beta-D-arabinofuranosyladenosine (ara-A) as a model compound. Towards this goal, we investigated in detail the effect of ara-A on the repair of DSB. We established that ara-A inhibits homologous recombination repair (HRR) and showed that this inhibition plays an important role in the radiosensitization of exponentially growing human tumor cells. We also examined the effect of ara-A on pathways of non-homologous end-joining (NHEJ). We found an increase in the frequency of erroneous DSB repair events in two cellular reporter assays. However, we could not detect a decrease by ara-A in the overall DSB repair efficiency in repair proficient cancer cells exposed to high doses of IR, when tested in the G1 or G2 phase of the cell cycle by pulsed-field gel electrophoresis (PFGE). This result implied a switch between DSB repair pathways, rather than an overall inhibition of DSB repair. Through examination of DSB repair by PFGE in repair deficient cells we could show for the first time promotion of error prone backup pathways of non-homologous end-joining (B-NHEJ) by a NA. Ara-A enhanced the repair of DSB by B-NHEJ in human tumor cells. Furthermore, ara-A treatment completely abrogated the plateau-phase-dependent inhibition of B-NHEJ in mouse cells, causing a dramatic restoration of DSB repair. Investigation of IR induced damage foci by immunofluorescence microscopy confirmed the above observations and implicated end-resection and deregulation of DSB signaling as underlying mechanisms. We conclude that in cycling cells treatment with ara-A causes direct inhibition of HRR resulting in radiosensitization. At the same time the balance of NHEJ is shifted towards the more error prone B-NHEJ. Over-activation of mutagenic B-NHEJ is likely to make an important contribution to radiosensitization by ara-A, especially in G1 and plateau phase cells, but also in G2 and S-phase cells. Our findings reveal a novel mechanism of radiosensitization by nucleoside analogs. That opens new avenues in the investigation of interactions of these drugs with IR and may have important implications for the clinical application of NAs as radiosensitizers.

Verbesserungen in der Behandlung von Krebsleiden zu erzielen gehört zu den großen Herausforderungen der modernen Medizin. Die Kombination von chemotherapeutischen Wirkstoffen mit Strahlentherapie um einen synergistischen Effekt bei der Abtötung von Tumorzellen zu erhalten, ist hierbei gegenwärtig einer der vielversprechendsten Ansätze. Das Ziel dieser Promotionsarbeit war es Mechanismen der Strahlensensibilisierung durch Nukleosidanaloge am Beispiel von 9-beta-D-Arabinofuranosyladenosin (ara-A) aufzuklären. Hierzu wurde der Einfluss von ara-A auf die Reparatur von DNA-Doppelstrangbrüchen (DSB) untersucht. Wir konnten beobachteten das ara-A Reparatur die homologe Rekombination (HRR) inhibiert und konnten zeigen das diese Hemmung eine wichtige Rolle bei der Strahlensensibilisierung von exponentiell wachsenden, humanen Tumorzellen spielt. Wir untersuchten auch die Effekte von ara-A auf Reparaturwege der nicht-homologen-Endverknüpfung (NHEJ). In zwei Reporterzellsystemen konnten wir einen durch ara-A ausgelösten Anstieg der Häufigkeit fehlerhafter DSB-Reparaturereignisse beobachten. Es konnte jedoch keine Veränderung der allgemeinen Effizienz der DSB Reparatur in Reparatur-kompetenten Zellen durch ara-A Behandlung in Pulsfeld-Gelelektrophorese-Experimenten (PFGE) festgestellt werden. Diese Ergebnisse deuteten auf eine Verschiebung der Aktivität zwischen verschiedenen Reparaturwegen anstelle einer allgemeinen Hemmung der Reparatur hin. Durch Untersuchung der DSB-Reparatur in Reparatur-inkompetenten Zellen mit Hilfe der PFGE konnten wir zum ersten Mal eine Beförderung der besonders fehleranfälligen, alternativen Backup-Mechanismen der NHEJ (B-NHEJ) durch ein Nukleosidanalog zeigen. Ara-A verstärkte die Reparatur von DSB durch B-NHEJ in aktiv wachsenden humanen Tumorzellen. Des Weiteren konnte in Mauszellen durch Behandlung mit ara-A die Plateauphase-abhängige Unterdrückung des B-NHEJ vollständig aufgehoben werden, was zu einem dramatischen Anstieg der Reparaturkompetenz in diesen Zellen führte. Die Untersuchung von durch ionisierende Strahlung hervorgerufenen, nukleären gamma-H2AX, ATM und 53BP1-Foci bestätigte diese Beobachtungen und deutete auf eine Deregulierung der durch DSB ausgelösten Signalwege und einer möglichen Rolle der Endresektion als zugrunde liegende Mechanismen hin. Wir schließen, dass Behandlung mit ara-A in proliferierenden Zellen durch direkte Hemmung der HRR zur Strahlensensibilisierung führt. Gleichzeitig wird die Balance des NHEJ in Richtung des fehlerhafteren B-NHEJ verschoben. Die Überaktivierung der mutagenen B-NHEJ trägt mit hoher Wahrscheinlichkeit ebenfalls zur Strahlensensibilisierung durch ara-A bei, vor allem in der G1- sowie der Plateau-Phase des Wachstums, aber auch in der G2- und S-Phase. Die Ergebnisse dieser Arbeit zeigen einen neuen Mechanismus der Strahlensensibilisierung durch Nukleosidanaloge auf. Diese neuen Erkenntnisse ermöglichen es neue Wege bei der Untersuchung der Interaktionen dieser Wirkstoffe mit ionisierender Strahlung zu beschreiten und könnten wichtige Implikationen für die klinische Anwendung von Nukleosidanalogen als Strahlensensibilisierer haben.

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Magin, Simon: A balance shift between error-free and error-prone DNA double-strand break repair pathways as a novel mechanism of radiosensitization by nucleoside analogs. 2014.

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