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Computational study of Sonic Hedgehog proteins : Insights into the role of metal ions

Rebollido-Rios, Rocio

The present work studies the effect of metal ions on the structure, dynamics and inter- actions of the protein ShhN, the N-terminal signaling domain of Sonic Hedgehog. To accomplish this task, molecular structures of ShhN proteins were analyzed with a set of computational methods, revealing new features of ShhN proteins. The results suggest that, ShhN is an enzyme with a zinc catalytic center that is regulated by the binding of the calcium ions. Explicitly, the binding of the second calcium ion involves a conformational change that is accompanied by a significant perturbation of the putative catalytic center, possibly affecting substrate stabilization. The dragging of E127 towards the calcium center implies the pulling of H135 with it and the disruption of the hydrogen bond between G128 and H141. Besides, the distance between residues E177 and H135 increases and therefore, the well-defined position of the catalytic water molecule is lost destabilizing the zinc environment. Electrostatic potential differences among calcium states suggest the possible binding of nonpolar substrates. One of the predictions is that ShhN autodegradates tuning its own concentration gradient. This possibility does not rule out, of course, the existence of other mechanisms that govern ShhN concentration gradient. The novel switching mechanism proposed could have many implications in the biological function of HhN proteins, but these are not well understood and require further research. Both ShhN monomers and dimers show a flexibility pattern that strongly depends on the number of calcium ions. Specially, calcium binding loops reflect this behavior. The Cardin- Weintraub motif located within the N-terminal of ShhN proteins together with buried hydrophobic residues at the interface lead to an stable complex that enhances ShhN dimerization. The lower degree of conservation of I48 in vertebrate homologs might indicate that this is a hot spot residue with an important role in ShhN oligomerization. The presence of the calcium ions at the dimeric interface can promote ShhN-proteoglycan interactions providing a large positively charged region which is the ideal scenario for the binding of these molecules. Taken all together, a multimerization model where different levels of interaction can control the way that ShhN multimers form is proposed. However, this model has yet to be tested.

Die vorliegende Arbeit untersucht die Frage: Welche Wirkung haben Metall-Ionen auf die Struktur, Dynamik und Wechselwirkungen des Proteins ShhN, der N-terminalen Signal- Domäne von Sonic Hedgehog? Zur Beantwortung wurden molekulare Strukturen von ShhN mit verschiedenen Computer-gestützten Methoden analysiert. Die Analysen sagen einige überraschende Eigenschaften von ShhN vorher. Zuerst legen die Analysen nahe, dass ShhN eine Zink-Protease ist, deren katalytisches Zentrum durch die Bindung von Calcium-Ionen reguliert wird. Speziell ändert die Bindung des zweiten Calcium-Ions die Konformation des Zink-Zentrums und beeinflusst so vermut- lich die Bindung des Substrats. Diese Konformationsänderung kaskadiert vom Calcium- Ion zum katalytisch Zink-Zentrum über mehrere Residuen und destabilisiert die Substrat- Bindestelle und das Zink-gebundene katalytische Wasser-Molekül. Änderungen des elektrostatischen Potenzials um das Zink-Zentrum in Abhängigkeit von der Calcium-Bindung weisen hin auf eher unpolare Substrate, z.B. den C-Terminus von ShhN. ShhN könnte also ShhN-Moleküle abbauen, und auf diese Weise seinen Konzentrationsgradienten än- dern. Die Implikationen des beschriebenen neuartigen Mechanismus der Schaltung von ShhN über Calcium-Ionen für die biologische Funktion des Proteins sind noch weitgehend unverstanden, und erfordern weitere Forschung. Die Flexibilität von ShhN-Monomeren und -Dimeren hängt stark ab von der Zahl der gebundenen Calcium-Ionen. Im Besonderen sind die Calcium-bindenden Schleifen von ShhN davon betroffen. ShhN-Dimere werden stabilisiert durch das Cardin-Weintraub-Motiv am N-Terminus und durch Wechselwirkungen mit hydrophoben Residuen an der Schnittstelle zwischen den Monomeren. Die schwächere Konservierung von I48 in Wirbeltieren kön- nte ein Hinweis sein auf eine wichtige Rolle dieses Residuums in der Oligomerisierung von ShhN. Die Nähe von Calcium-Ionen zur Dimerisierungs-Region sorgt für ein positives elektrostatisches Potenzial und könnte so die Bindung von Proteoglykanen fördern. Ins- gesamt wird ein Modell der Multimerisierung von ShhN vorgeschlagen, das über mehrere Kontrollmechanismen verfügt, die experimentell getestet werden sollten.

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Rebollido-Rios, Rocio: Computational study of Sonic Hedgehog proteins. Insights into the role of metal ions. 2014.

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