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Funktionelle Charakterisierung potenzieller Exportsignale und Interaktionen innerhalb der IAP-Familie

Hecht, Rouven LSF

Apoptose ist ein stark regulierter Prozess, welcher von einer Vielzahl pro- und antiapoptotischer zellulärer Proteine reguliert wird. Neben den pro-apoptotischen Caspasen spielen hier die anti-apoptotischen Mitglieder der IAP (Inhibitors of Apoptosis Proteins) -Familie eine wichtige Rolle. Sie sind hochkonserviert und wurden neben den Vertebraten auch in Insekten und Hefen beschrieben (Crook et al. 1993). Im Menschen konnten bislang acht Mitglieder dieser Familie identifiziert werden, von denen Survivin und XIAP die am besten untersuchten IAPs sind, da ihnen essentielle Funktionen im Verlauf der Karzinogenese zugesprochen werden (Dohi 2004, Mehrotra et al. 2010). Auf Grund seiner postulierten antiund pro-apoptotischen Eigenschaften ist mit Livin ein weiteres IAP in den Fokus der Tumorforschung gerückt (Boaz Nachmias 2003). Abgesehen von seiner Funktion als Apoptose-Inhibitor ist Survivin im Verlauf der Zellteilung für eine korrekte Verteilung der Chromosomen verantwortlich, in dem es als Teil des CPC für dessen Anlagerung an die Zentromere sorgt. Dies geschieht über ein hydrophobes Leucin-reiches Exportsignal (NES), welches in der Sequenz von Survivin verankert ist. Dadurch wird die Interaktion mit dem Exportrezeptor Crm1 ermöglicht, welche für die Bindung des CPC an die Chromosomen essentiell ist (Knauer et al. 2007). Wie für Survivin sind auch für XIAP nicht nur regulatorische Prozesse innerhalb der Apoptose beschrieben. XIAP ist ebenso involviert in die Aktivierung von Nf-κB, JNK und die Aufrechterhaltung des Kupfer-Metabolismus (Galbán und Duckett 2009). Anlässlich dieser Multifunktionalität sollte im ersten Teil dieser Arbeit XIAP auf das Vorhandensein eines NES hin untersucht werden, welches ein wichtiger Bestandteil für die Ausführung seiner zellulären Aufgaben ist. Dabei konnte durch LMB-Behandlung und die daraus folgende Akkumulation im Zellkern in der Tat auf die Existenz eines NES in XIAP geschlossen werden. Durch in silico-Sequenzanalysen und mittels Mikroinjektionsexperimenten sowie umfassenden molekularbiologischen und biochemischen Analysen wurde dies nicht nur bestätigt, sondern weist sogar auf eine mögliche kombinatorische Wirkung von mehreren potenziellen NES in XIAP hin. Während Interaktionsstudien indes die Abhängigkeit des intrazellulären Transports von einer möglichen Wechselwirkung mit Survivin nahezu ausschließen konnten, deutet die publizierte intranukleäre Akkumulation von XIAP in Verbindung mit XAF1 auf eine Interaktion dieser beiden Proteine hin (Peter Liston und Tamai 2001). Das in dieser Beziehung neu beschriebene NES in XAF1 kann in diesem Zusammenhang ebenfalls zum nukleären Export von XIAP beitragen. So könnte würde die Exportinhibition durch LMB nicht nur den Transport von XIAP selbst, sondern darüber hinaus auch von XAF1 einschränken. Weitere Untersuchungen könnten klären, ob die Translokation von XAF1 ebenfalls von einer Interaktion mit Crm1 abhängt und welchen Einfluss eine siRNA-basierte Verminderung der XAF1-Expression auf die subzelluläre Lokalisation von XIAP hat und umgekehrt. Um besser zu verstehen, wie Survivin als Apoptose-Inhibitor agiert, wurden im Rahmen dieser Arbeit mögliche Wechselwirkungen mit anderen IAPs untersucht. Anhand von Ko-Immunpräzipitationsanalysen konnte erstmalig gezeigt werden, dass Survivin neben der bereits beschriebenen Interaktion mit XIAP auch an Livin zu binden vermag. Um die funktionelle Relevanz dieser Interaktion verstehen zu können, wurde zunächst die proapoptotische Eigenschaft von Livin genauer untersucht. Dabei wurde bestätig, dass u.a. Caspase-3 für die proteolytische Spaltung von Livin verantwortlich ist und so das proapoptotisch wirkende C-terminale Fragment entsteht, welches in einer perinukleären Ringstruktur im endoplasmatischen Retikulum akkumuliert (Boaz Nachmias 2003, Nachmias et al. 2007). Weiterführende Versuche wiesen eine stärkere Bindung von Survivin an die Cterminale Livin-Variante als an den Wildtyp nach. Dies deutet vermehrt auf eine antiapoptotische Wirkweise von Survivin hin, welche über die pro-apoptotische Eigenschaft von tLivinlong vermittelt wird. Dies führte zu der Hypothese, dass eine Hochregulation von Survivin und Livin in frühen Phasen der Tumorentwicklung, zu einer Stabilisierung von Livin durch Survivin führt und es so nicht in mehr seine pro-apoptotische Form gespalten werden kann. Einen Hinweis darauf gab die Kotransfektion von Livin und Caspase-3 in Survivin konstitutiv exprimierenden A431-Zellen, in denen Livin im Vergleich zu den entsprechenden parentalen Zellen, nicht mehr prozessiert wurde und seinen anti-apoptotischen Phänotyp beibehielt. Die Prozessierung von Livin wird normalerweise durch Caspase-3 vermittelt, welche wiederum durch die Überexpression von Survivin gehemmt werden kann. Weiterführende Experimente sollten sich neben der Aufklärung der Apoptoseinduzierenden Mechanismen der C-terminalen Spaltform von Livin im ER und mit der Analyse zellulärer Vitalität in Abhängigkeit der transfizierten Livin-, Survivin- und Caspase-3-Konstrukte beschäftigen. Zusammenfassend konnte diese Arbeit neue Einblicke in die pro-apoptotische Wirkung von Livin geben und durch die Entdeckung einer bislang unbekannten Interaktion mit Survivin einen neuen Aspekt in dessen biologischer Funktion aufdecken. Des Weiteren wurden erste Hinweise auf die Existenz eines Exportsignals in der Sequenz von XIAP sowie auf eine relevante, bisher unbekannte Verbindung zu XAF1 gewonnen. Dies eröffnet nun neue Wege im Verständnis der Multifunktionalität von XIAP.

The process of apoptosis is a tightly controlled mechanism which is regulated by a high number of different pro- and anti-apoptotic cellular proteins. Besides the pro-apoptotic Caspases, the highly conserved family of intracellular inhibitors of apoptosis proteins (IAPs) play an important role. Eight members have been identified in humans so far, yet they are also found in insects, yeast and a wide range of vertebrates (Crook et al. 1993). Due to their pivotal role in the carcinogenesis, Survivin and XIAP are the two best studied IAPs (Dohi 2004, Mehrotra et al. 2010). However, due to its ability to act as both anti- and pro-apoptotic factor during early stages of apoptosis, the small IAP Livin has also come into focus of many cancer related studies (Boaz Nachmias 2003). Besides its function as an inhibitor of apoptosis, Survivin plays also an important role during mitosis as part of the CPC ensuring the correct distribution of the chromosomes. This is mediated via an intrinsic hydrophobic, leucine-rich export signal (NES) in Survivin, which is essential for interaction with the export receptor Crm1 and the tethering of the CPC to the centromeres (Knauer et al. 2007). Similar to Survivin, also XIAP is not merely known as a regulator of apoptosis. It is also involved in several processes like NF-κB and JNK activation and the maintenance of copper metabolism (Galbán und Duckett 2009). Due to this multifunctionality, the first part of this work aimed to define whether XIAP might contain a so far unknown NES and to evaluate its localization and possible importance for the proper cellular function of XIAP. LMB-treatment of Hela cells transiently transfected with pc3-XIAPWT-GFP resulted in a significant protein accumulation in the nucleus. This served as a first hint for the existence of NES in XIAP. In silico sequence analyzes and microinjection experiments in combination with comprehensive molecular and biochemical methods not only confirmed the existence of the predicted export signal, but also pointed towards a possible combinatorial effect of several potential NES in XIAP. Whereas interaction studies nearly excluded the possibility of an interdependence of intracellular transport and an interaction with Survivin, the published nuclear accumulation of XIAP connected with XAF1 indeed indicates an interaction between these two proteins (Peter Liston und Tamai 2001). In this context, the newly described NES in XAF1 could also contribute to the nuclear export of XIAP. Accordingly, inhibition of nuclear export by LMB would not only affect the transport of XIAP itself but also nuclear export of XAF1. To achieve a better understanding of how Survivin acts as an apoptosis regulator, we investigated its possible interplay with other IAP-members. In immunoprecipitation experiments we could demonstrate for the first time that there is not only an interaction between Survivin and XIAP but also between Survivin and Livin. In order to clarify the functional relevance of this interaction, at first, Livin’s pro-apoptotic property was investigated in more detail. It could be confirmed that Caspase-3 is responsible for the proteolytical cleavage of Livin into its pro-apoptotic C-terminal fragment, which accumulates in a ring-like structure around the nucleus corresponding to the endoplasmic reticulum (Boaz Nachmias 2003, Nachmias et al. 2007). Ensuing experiments showed a higher binding affinity of Survivin to the C-terminal variant compared to the wildtype. This points to an additional anti-apoptotic activity of Survivin, which is mediated via the formation of tLivinlong. This in turn raises the hypothesis of a correlated protein up-regulation of Survivin and Livin in early stages of tumor development, where Survivin might stabilize Livin by binding and thus prevents it from cleavage into its assumed pro-apoptotic truncated C-terminal form. This hypothesis could be verified by co-transfection experiments showing that Livin was processed into its pro-apoptotic form when transfected together with Caspase-3 in parental A431 cells but not in cells stably overexpressing Survivin, which in turn is able to inhibit Caspase-3. In summary, the results of this work could give new insights into the pro-apoptotic effects mediated by Livin and via the discovery of a so far unknown interaction with Survivin unravel a new aspect in its biological function. Additionally, data hint towards the existence of a nuclear export signal in XIAP and support a so far unknown connection to XAF1. This now paves the way to better understand the multifunctionality of XIAP.

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Hecht, Rouven: Funktionelle Charakterisierung potenzieller Exportsignale und Interaktionen innerhalb der IAP-Familie. 2014.

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