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Ein spezifisches Nachweisverfahren für S-Nitrosothiole

Wiesweg, Marcel

Stickstoffmonoxid (NO) ist als einer der bedeutendsten physiologischen Mediatoren an zahlreichen Regulationsvorgängen beteiligt. Während NO sehr rasch abgebaut wird, stellen die aus einer Reaktion von NO mit Thiolen im Organismus entstehenden S-Nitrosothiole stabilere Verbindungen dar. Nachdem S-Nitrosothiole zunächst als mögliche Transport- und Speicherformen des kurzlebigen NO angesehen wurden, kann die S-Nitrosierung von Proteinen eine posttranslationale Modifikation darstellen und intrazelluläre Signalwege beeinflussen. Zur Untersuchung dieser postulierten Abläufe ist letztendlich der analytische Nachweis der S-Nitrosierung von Proteinen notwendig, was üblicherweise mit Hilfe der sogenannten „Biotin-Switch“-Technik erfolgt. Hierbei werden die S-Nitrosothiole zum korrespondierenden Thiol reduziert, das im Weiteren mit einem Antikörper nachgewiesen wird. Diese Reduktion bestimmt die Spezifität und Sensitivität des Nachweises. Als Reagenz für diesen entscheidenden Schritt ist auschließlich Ascorbinsäure etabliert, obwohl hiermit nur suboptimale, nicht stöchiometrische Ausbeuten möglich sind. Im Rahmen dieser Arbeit wird gezeigt, dass der Raketentreibstoff Methylhydrazin als spezifisches und effektives Reduktionsmittel für die Reduktion von S-Nitrosothiolen eingesetzt werden kann. Die Reaktion generiert ausschließlich die korrespondierende Thiol-Funktion, ohne unspezifisch andere Verbindungen, wie insbesondere Disulfide, zu reduzieren. Die Ergebnisse konnten mit niedermolekularen S-Nitrosothiolen wie auch mit S-nitrosierten Proteinen bestätigt werden; es war möglich, durch Optimierung der Reaktionsbedingungen eine hohe Reaktionsausbeute (>90%) zu erzielen. Der zugrunde liegende chemische Reaktionsmechanismus wurde aufgeklärt. Durch ein angepasstes Färbeprotokoll mit Einsatz des neuen Reduktionsmittels konnte erstmals fluoreszenzmikroskopisch ein Signal für native S-Nitrosothiole auf histologischen Schnitte nachgewiesen werden. Schließlich gelang es, in der „Biotin-Switch“-Technik die Überlegenheit von Methylhydrazin zu demonstrieren.

Reduction of S-nitrosothiols to the corresponding thiol function is the key step in analyzing S-nitrosocysteinyl residues in proteins. Though it has been shown to give low yields, ascorbate-dependent reduction is commonly performed in the frequently used biotin-switch technique. We demonstrate that the compound methylhydrazine can act as a specific and efficient reducing agent for S-nitrosothiols. The corresponding thiol function is exclusively generated from low molecular weight and proteinaceous S-nitrosothiols while methylhydrazine failed to reduce disulfides. It was possible to optimize the experimental conditions so that thiol autoxidation is excluded, and high reaction yields (>90%) are obtained for the thiol function. The biotin-switch technique performed with methylhydrazine-dependent reduction shows remarkably improved sensitivity compared to the ascorbate-dependent procedure.

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Wiesweg, Marcel: Ein spezifisches Nachweisverfahren für S-Nitrosothiole. 2014.

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