Contributions of NHEJ and HRR in the processing of DNA double strand breaks and chromosome breaks throughout the cell cycle
DNA double strand breaks (DSBs) are the most deleterious lesions induced by ionizing radiation (IR), which if unrepaired or misrepaired can cause chromosomal aberrations and lead to genomic instability or cell death. In higher eukaryotic cells the two main repair pathways DNA-PK dependent non-homologous end joining (D-NHEJ) and homologous recombination repair (HRR) are responsible for the repair of DSBs. An alternative pathway of NHEJ termed B-NHEJ operates as a backup, when D-NHEJ is compromised.
In this work we want to elucidate the contributions and the interplay of the three repair pathways HRR, D-NHEJ and B-NHEJ in the processing of DNA DSBs and chromosomal breaks throughout the whole cell cycle and in G2-phase cells in particular. Additionally we want to investigate if a dose depended switch for the repair pathway choice exists.
Recent findings of our group show that RAD51 foci saturate after exposure to higher doses and that the repair of IR induced chromosomal breaks at small doses (0.5 - 2 Gy) is almost completely inhibited in HRR mutants. Nevertheless, normal repair of DNA DSBs is revealed in HRR mutants obtained by PFGE after high doses.
In order to further investigate this observation, we performed PFGE and G2-PCC experiments using a broad, overlapping dose-spectrum, analyzing repair outcomes after DNA damage induction at lower doses than typical for PFGE, and at higher doses than typical for G2-PCC. Our G2-PCC results show that the impaired repair of chromosomal breaks in HRR deficient cells at low doses recovers after exposure to 5 Gy of IR. This result gives additional evidence that at low doses HRR is the dominant pathway. Additionally the inhibition of PARP-1, an important component of B-NHEJ, results in a decrease in the repair of G2-PCC breaks, showing the involvement of B-NHEJ in the repair of lesions induced at high doses in HRR deficient cells.
It has been widely shown that B-NHEJ is responsible for the formation of chromosomal translocations (CTs) and chromosomal exchanges (CEs). We observed a strong increase in the frequency of CE formation at 5 Gy compared to the frequency of CEs in cells irradiated with 1 Gy that further strengthens the involvement of B-NHEJ in the repair of G2-PCC breaks in HRR deficient cells at 5 Gy.
In order to further investigate the involvement of B-NHEJ in DSB repair we analyzed CE formation after inhibiting B-NHEJ with PARP inhibitors in D-NHEJ deficient cells. In addition to our results showing that B-NHEJ is involved in the repair of DNA damage in HRR deficient cells resulting in high frequency of CEs formation, we show that wild type and D-NHEJ deficient cells have a lower frequency of CEs compared to HRR deficient cells. These experiments help us to elucidate potential interactions and/or mutual regulations between B-NHEJ and D-NHEJ.
Collectively, these results allow us to suggest that in the G2- phase of the cell cycle B-NHEJ backups HRR as efficiently as D-NHEJ. Furthermore we revealed the important role of PARP-1 in the formation of CEs in G2-phase at clinically relevant doses i.e. 1 or 2 Gy.
Die durch ionisierende Strahlung induzierten DNA-Doppelstrangbrüche (DSB) sind die schädlichsten Schäden an der DNA welche, wenn sie nicht oder falsch repariert werden, chromosomale Aberrationen verursachen und auch zur genomischen Instabilität und zum Zelltod führen können. Die beiden Hauptreparaturwege in höheren eukaryotischen Zellen die für die Reparatur von DSB verantwortlich sind, heißen DNA-PK-abhängige nicht-homologe Endverknüfung (D-NHEJ) und homologe Rekombinationsreparatur (HRR). Zusätzlich gibt es einen alternativen Reparaturweg der aktiv ist, wenn D-NHEJ nicht in der Lage ist zu agieren, aus diesem Grund wird er auch als Backup-Reparaturweg (B-NHEJ) bezeichnet.
In dieser Doktorarbeit wollen wir erforschen, wie viel die drei Reparaturwege HRR, D-NHEJ und B-NHEJ zu der Reparatur von DNA DSB und Chromosomenbrüchen während des gesamten Zellzykluses und besonders in den G2-Phase-Zellen beitragen. Außerdem wollen wir versuchen etwas über ein mögliches Zusammenspiel zwischen den drei Reparaturwegen herauszufinden und ob die Wahl der Zelle über die Reparaturwege abhängig ist von der Dosis.
Neuere Erkenntnisse aus unserer Arbeitsgruppe zeigen, dass sich die Rad51 Fokusse nach einer Exposition mit höheren Dosen sättigen. Zusätzlich wurde herausgefunden, dass in HRR Mutanten die Reparatur von durch ionisierende Strahlung induziert Chromosomenbrüchen, bei kleinen Dosen (0,5 bis 2 Gy), fast völlig gehemmt ist. Dennoch wurde durch PFGE gezeigt, dass HRR Mutanten eine normale Reparatur von DNA DSB nach hohen Dosen aufweisen.
Damit diese Beobachtungen weiter untersucht werden, führten wir PFGE und G2-PCC-Experimente mit einem breiten überlappenden Dosis Spektrum durch, damit wir die Reparatur von DNA-Schäden nach niedrigen Dosen in PFGE und nach hohen Dosen in G2-PCC analysieren können. Unsere G2-PCC Ergebnisse zeigen, dass die beeinträchtigte Reparatur von Chromosomenbrüchen in HRR defizienten Zellen, nach einer Bestrahlung mit niedrigen Dosen, zurückgewonnen werden kann, indem die Zellen mit 5 Gy bestrahlt werden. Dieses Ergebnis liefert einen zusätzlichen Beweis dafür, dass HRR bei niedrigen Dosen der dominierende Reparaturweg ist. Zusätzlich wird gezeigt, dass die Inhibierung von PARP-1, einem wichtigen Bestandteil von B-NHEJ, zu einer Abnahme in der Reparatur von G2-PCC Brüchen führt, dies zeigt die Beteiligung von B-NHEJ an der Reparatur von G2-PCC Brüchen in HRR defizienten Zellen nach höheren Dosen.
Des Weiteren wurde gezeigt, dass B-NHEJ für die Bildung von chromosomalen Translokationen (CT) und Chromsomalen Austausch (CE) verantwortlich ist. Im Vergleich zur Frequenz der CE Bildung in HRR Mutanten, die mit 1 Gy bestrahlt wurden, haben wir einen starken Anstieg in der Häufigkeit der CE-Bildung bei einer Bestrahlung von 5 Gy beobachtet, auch dies bestärkt, dass B-NHEJ an der Reparatur von G2-PCC Brüchen in HRR defizienten Zellen nach einer Bestrahlung mit höheren Dosen beteiligt ist.
Um die Beteiligung von B-NHEJ in der DSB-Reparatur weiter zu untersuchen, haben wir die Bildung von CE und CT, nach der Inhibierung von B-NHEJ, in D-NHEJ -defizienten Zellen analysiert. Zusätzlich zu unseren Ergebnissen die zeigen, dass B-NHEJ an der Reparatur von G2-PCC Brüchen in HRR defizienten Zellen beteiligt ist, zeigen wir, dass Wildtyp und D-NHEJ-defiziente Zellen im Vergleich zu HRR defizienten Zellen weniger CEs aufweisen. Wir versuchen mit diesen Experimenten potenzielle Wechselwirkungen und/ oder gegenseitigen Regulierung zwischen B-NHEJ und D-NHEJ aufzuklären.
Wir konnten vorzeigen, dass in der G2-Phase des Zellzykluses B-NHEJ bevorzugt der Backup für HRR als für D- NHEJ ist. Außerdem konnten wir zeigen, dass PARP-1 eine wichtige Rolle bei der Bildung von CE und CT in der G2-Phase spielt, nach Anwendung von klinisch relevanten Dosen, z.B. 1 oder 2 Gy.
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