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Untersuchung der Neuroblastompathogenese aus Neuralleistenvorläuferzellen in vitro und in vivo

Lindner, Sven

Das Neuroblastom (NB) ist der häufigste extrakranielle Tumor des Kindesalters. Es deuten viele Hinweise darauf hin, dass das NB aus Neuralleistenvorläuferzellen (NLVZ) entsteht. In dieser Arbeit wurde eine durch c-Myc immortalisierte NLVZ-Linie genutzt, um die initiale Pathogenese des NB zu untersuchen. Durch Transfektion der NLVZ-Linie JoMa1 mit MYCN, LIN28b, FOXR1, ALK-WT ALK[F1174L] und ALK[R1275Q] konnte gezeigt werden, dass NLVZ durch potentielle Onkogene des NB in vitro transformiert werden können. Weiterhin konnte gezeigt werden, dass JoMa1 Zellen durch MYCN und ALK[F1174L] derart transformiert werden, dass sie in vivo NB ähnliche Tumore bilden. Darüber hinaus zeigten die durch JoMa1-MYCN entstandenen Tumoren, spezifische chromosomale Aberrationen, die homolog zu denen des humanen NB sind. Außerdem wiesen die Tumoren mikroskopische Strukturen auf, die typisch für neuroendokrine Tumoren sind. Es wurde jedoch auch deutlich, dass nicht die Überexpression jedes x-beliebigen Gens zur Transformierung von NLVZ in vitro und in vivo führt. Die Gene TrkA, miR-17-92, MLL-FOXR1 und GFP lösten keine Transformierung in JoMa1-Zellen aus. Zusammengenommen zeigen diese Resultate, dass sich JoMa1 als Modell für die funktionelle Untersuchung NB-relevanter Onkogene eignet. Gestützt von in vitro Daten und Hochdurchsatzanalysen wurde LIN28b als wichtiges Onkogen im NB identifiziert. LIN28b ist häufig genomisch amplifiziert und hoch exprimiert. Molenaar et al. zeigten, dass LIN28b in humanen NB Zelllinien entscheidend für die Viabilität ist. Darüber hinaus wurde deutlich, dass LIN28b in humanen NB Zelllinien miRNAs der let-7 Familie reprimierte, was zu De-Reprimierung von MYCN führte und die Viabilität steigerte. Diese LIN28b-let-7-Mycn regulatorische Achse ließ sich auch in JoMa1 Zellen, die mit LIN28b transfiziert wurden, nachweisen. Mittels der in dieser Arbeit etablierten und charakterisierten transgenen LSL-Lin28b (Lox-Stop-Lox-Lin28b-IRES-FLuc) Maus sollte die neuralleistenspezifische Expression von Lin28b näher untersucht werden. Dafür wurden die LSL-Lin28b Mäuse mit Dbh-iCre Mäusen verpaart. LSL-Lin28b;Dbh-iCre doppelt transgene Mäuse exprimieren konditional Lin28b in der Neuralleiste und in Neuralleistenderivaten. 35% dieser doppelt transgenen Mäuse entwickelten mit einem durchschnittlichen Altern von 65 Tagen tastbare Tumoren. Die Tumoren entstanden aus den Neuralleistenderivaten, aus denen sie auch beim humanen NB entstehen (z.B. Nebennierenmark). Mittels Luciferase-Aktivitäts-Bestimmung konnte gezeigt werden, dass Lin28b in den Tumoren exprimiert wird. Die Untersuchung der Tumoren hinsichtlich der Expression humaner NB Markergene zeigte, dass es sich bei den Tumoren um murine NB handelte. Die Tumoren exprimierten Dbh, Th und NSE. Interessanterweise wiesen diese Tumore chromosomale Aberrationen auf, die zu denen des humanen NB homolog sind. Wie in JoMa1-LIN28b, so konnte auch in den Tumoren des LSL-Lin28b;Dbh-iCre Mausmodells die funktionale regulatorische Lin28b-let-7-Mycn Achse nachgewiesen werden. Abschließend konnte gezeigt werden, dass der Bromodomänen-Inhibitor JQ1 die Mycn Expression und Mycn gesteuerte Transkription inhibiert. Dies hatte zur Folge, dass die Apoptose in den Tumoren stark erhöht war und die Proliferation stark gesenkt wurde. Das LSL-Lin28b;Dbh-iCre Mausmodell stellt damit ein präklinisches Modell zur Untersuchung der NB Pathogenese dar.

Neuroblastoma is presumed to arise from the neural crest, whereas the cells of origin remain to determined. To date, few recurrent genetic changes contributing to neuroblastoma formation, such as amplification of the MYCN oncogene and activating mutations of the ALK oncogene, have been identified. The possibility to model neuroblastoma in mice allows investigation of the cells of origin hypothesis in further detail. Murine neural crest progenitor cells, JoMa1 cell line, were maintained in an undifferentiated state by a tamoxifen-activated c-Myc transgene (c-Myc-ERT). Either MYCN, ALK[F1174L], one of the oncogenic ALK variants identified in primary neuroblastomas, TrkA or GFP were ectopically expressed. Subsequently, growth independence of c-Myc-ERT transgene was monitored in vitro, and tumorigenicity of transfected cells was evaluated in an in vivo model. JoMa1 cells expressing MYCN or ALK[F1174L] were able to grow independently of c-Myc-ERT activity in vitro and caused formation of tumors in vivo, in contrast to parental JoMa1 cells and JoMa1 cells expressing TrkA, miR-17-92, MLL-FOXR1 or GFP. Tumors resembled human neuroblastomas in morphology, expression of neuroblastoma marker genes TH, Phox2b, DC56 and in the presence of neurosecretory vesicles and synaptic structures as determined by electron microscopy. Tumorigenicity was enhanced upon serial transplantation of tumor-derived cells. Our findings support neural crest progenitor cells as the precursor cells of neuroblastoma, and indicate that neuroblastoma arise as their malignant progeny. The JoMa1 model system is a valid and fast tool to analyze the effect of genes suspected to contribute to neuroblastomagenesis in an in vivo model or to implement screening strategies to identify such genes. The former strategy has already been successfully applied for FOXR1, LIN28b and miR-17-92. Overexpression of LIN28b has been reported in neuroblastomas (NB). LIN28b is known to repress let-7 miRNAs, which target MYCN. We overexpressed murine Lin28b in the neural crest to determine if Lin28b can drive neuroblastomagenesis. Conditional murine Lin28b expressing mice (LSL-Lin28b) were crossbred with Dbh-iCre mice to target expression to the neural crest. Arising tumors were characterized using histology, immunohistochemistry, PCR and western blotting. 30% of all LSL-Lin28b;Dbh-iCre double-transgenic mice developed tumors at a median age of 65 days. The macroscopic tumor appearance, primary tumor sites, tumor histology and marker gene expression confirmed these tumors as murine NB. Lin28b and Mycn proteins were expressed in all tumors and let-7 miRNAs were downregulated. Treating mice with the bromodomain inhibitor JQ1 resulted in enhanced cell death and decreased cell proliferation. Our results suggest that, similar to human NB, MYCN is induced via downregulation of let-7 miRNAs by Lin28b. Therapeutic approaches aimed at inhibiting Lin28b-let-7 interaction may be a useful therapeutic perspective.

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Lindner, Sven: Untersuchung der Neuroblastompathogenese aus Neuralleistenvorläuferzellen in vitro und in vivo. 2014.

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