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Zusammenwirken des Prokarzinogens Benzo[a]pyren mit pflanzlichen Flavonoiden auf karzinogenese-relevante Prozesse in Kolon-Adenokarzinoma-Zelllinie Caco-2

van Liempt, Manuela

In dieser Arbeit sollte die Fähigkeit verschiedener pflanzlicher Flavonoide zur Prävention von Darmkrebs nachgewiesen werden. Als Testsystem wurden daher humane Kolon-Andenokarzinoma-Zellen (Caco-2), als schädigendes Agenz das bekannte Prokarzinogen Benzo[a]pyren, sowie die Flavonoide Galangin, Quercetin, Myricetin und Kaempferol, verwendet. Da Flavonoiden eine Vielzahl antikarzinogener Eigenschaften zugewiesen werden, wie Hemmung von Phase I-Enzymen, Induktion von Phase II-Enzymen, Induktion der Apoptose, Hemmung der Zellproliferation, antioxidative Wirkung und Modulation des Immunsystems (Watzl & Rechkemmer 2001, Theodoratou et al. 2007, Flis et al. 2012), wurden in dieser Arbeit Effekte von Flavonoiden auf verschiedene Karzinogenese-relevante Prozesse wie DNA-Schädigung, Apoptose, Zellzyklus und damit zusammenhängende Signalwege (AhR, MAPK, Nrf2 und AKT) in Kolon-Adenokarzinoma-Zellen untersucht. Auch die Ausbildung reaktiver Metabolite ist von entscheidender Bedeutung, da Benzo[a]pyrene (BaP) durch die Metabolisierung über Monooxygenasen (Cytochrom P450 (CYP) Enzyme) und Hydrolasen zu dem reaktiven Benzo[a]pyren-7,8-dihydrodiol-9,10-epoxid umgewandelt wird. Diese Metabolisierung wird von Benzo[a]pyren selbst initiiert, da es über den Arylhydro¬karbon-Rezeptor-(AhR)-Signalweg das relevante, Cytochrom P450 Enzym, CYP1A1 induziert. Auch Flavonoide sind Agonisten des Arylhydrokarbon-Rezeptor-(AhR)-Signalweges, welcher eine tragende Rolle in der Regulation des Fremdstoff¬metabolismus im Darm hat. Nicht nur die generellen Effekte der Flavonoide selbst auf diese Prozesse sondern auch die des Prokarzinogens Benzo[a]pyren (BaP) wurden zunächst untersucht. Die präventiv wirkenden Effekte der Flavonoide wurden auch in Kombination mit dem Prokarzinogen analysiert. Für BaP wurde die Induktion von DNA-Schäden direkt und zudem über die Aktivierung eines spezifischen DNA-Schaden-Markers (H2Ax) nachgewiesen. Flavonoide erzeugten generell keine DNA-Schäden in den Kolon-Andenokarzinoma-Zellen, konnten aber die BaP-induzierten DNA-Schäden ver¬hindern. Allerdings zeigten die Flavonoide Quercetin und Myricetin zumindest auf die Aktivierung des DNA-Schaden-Markers (H2Ax) einen induzierenden Effekt. Apoptose wurde in den Kolon-Adenokarzinom-Zellen nur durch Benzo[a]pyren nicht aber durch die Flavonoide induziert. Dies konnte durch verschiedene Apoptose-Parameter bestätigt werden, wie die Caspase-3-Aktivität, das pro-apoptotische Protein Bax und das anti-apoptotische Protein Bcl-2. Flavonoide wirkten auch der Benzo[a]pyren-induzierten Apoptose entgegen. Für den Nachweis der Effekte auf den Zellzyklus wurde dieser direkt und anhand verschiedener Komponenten der Zellzyklus-Kontrolle, wie p21, p27, NFB, und die Phosphorylierung des Retinoblastoma-Proteins (pRb) untersucht. Generell hatten Benzo[a]pyren und Flavonoide keinen Effekt auf den Zellzyklus und dessen regulierende Komponenten, mit Ausnahme der Phosphorylierung des Retino-blastoma-Proteins. Dies konnte sowohl durch Benzo[a]pyren, als auch durch Quercetin signifikant induziert werden. Alle Flavonoide blockierten aber effizient die Benzo[a]pyren-abhängige pRb-Phosphorylierung. Benzo[a]pyren und Flavonoide hatten Einfluss auf die Signalwege MAPK, Nrf2 und AKT, die Wirkungen waren aber weitestgehend nicht signifikant. Auf den Arylhydrokarbon-Rezeptor-Signalweg konnte ein deutlicher Einfluss von Benzo[a]pyren und Flavonoiden in den Kolon-Adenokarzinom-Zellen festgestellt werden. BaP und Quercetin steigerten signifikant den Level von CYP1A1-mRNA und -Protein, aber auch Galangin und Myricetin übten hierauf einen leicht induzierenden Effekt aus. Die mRNA-Level der Komponenten des AhR-Komplexes (AhR, AhRR und AIP) wurden weder durch Benzo[a]pyren noch durch die Flavonoide beeinflusst, lediglich Myricetin hatte auf das mRNA-Niveau der Komponenten AhR und AhR-Repressor einen signifikant inhibierenden Effekt. Zudem konnten Benzo[a]pyren sowie Flavonoide die CYP1A1-Aktivität in den Kolon-Adenokarzinoma-Zellen deutlich steigern. Jedoch wirkten die Flavonoide auch den Benzo[a]pyren-mediierten Effekten auf den Arylhydrokarbon-Rezeptor-Signalweg inklusive der CYP1A1-induktion entgegen. Flavonoide nahmen durch Enzymhemmung auch direkten Einfluss auf die CYP1A1-Aktivität. Detailliertere Untersuchungen zur CYP1A1-Hemmwirkung der Flavonoide mit Lebermikrosomen zeigten, dass ihr Inhibitionspotential mit steigender Zahl an Hydroxylgruppen im B-Ring abnahm, während ihr Radikalfängerpotential zunahm. Durch den Einsatz eine Arylhydrokarbon-Rezeptor Inhibitors konnte die Abhängigkeit der Flavonoidwirkung auf die einzelnen Karzinogenese-relevanten Prozesse nachgewiesen werden. Hieraus lässt sich generell schließen, dass die Benzo[a]pyren-mediierten Effekte und die präventive Wirkung der Flavonoide auf der Beeinflussung des Arylhydrokarbon-Rezeptor-Weges und im Speziellen des Enzyms CYP1A1 basierten. Die Schlussfolgerung aus allen Ergebnissen ist, dass Flavonoide in Kolon-Adenokarzinom-Zellen einen signifikanten Präventions-Effekt auf BaP-induzierte Karzinogenese-relevante Prozesse besitzen.

In this thesis, possible preventive effects of several plant flavonoids on processes with relevance for colon-carcinogesis were investigated. As model system colon-adeno¬carcinoma-cells, the procarcinogen benzo[a]¬pyrene (BaP) as damaging substance and the flavonoids galangin, quercetin, myricetin and kaempferol were used for the experiments. A multitude of anti-cancer characteristics are assigned to flavonoids, like inhibition of phase I enzymes, induction of phase II enzymes, induction of apoptosis, inhibition of cell proliferation, antioxidative effects or modulation of the immunesystem (Flis et al. 2012, Theodoratou et al. 2007, Watzl & Rechkemmer 2001). Therefore, effects of flavonoids on multiple carcinogenesis relevant processes such as DNA-damage, apoptosis, cell cycle and related signal pathways (AhR, MAPK, Nrf2 and AKT) were investigated in colon-adenocarcinoma-cells. Additionally, the formation of reactive metabolites plays an important role, because benzo[a]pyrene gets metabolised via cytochrome P450 monooxygenase enzymes and hydrolases to reactive benzo[a]pyrene-7,8-dihydrodiol-9,10-epoxide, which causes DNA-adduct formation. As an agonist of the arylhydrocabon-receptor, benzo[a]pyrene itself initiates its own metabolism by induction of the metabolising cytochrome P450 enzyme CYP1A1. Flavonoids are also agonists of the arylhydrocarbon-receptor-pathway which plays an important role in the regulation of colon xenobiotic metabolism. Besides the basic effects of flavonoids and benzo[a]pyrene on carcinogenesis relevant processes, the preventive effects of flavonoids were studied in combination experiments with benzo[a]pyrene. Benzo[a]pyrene was proven to induce DNA-damage as shown directly by a Comet-assay and via induction of a specific DNA-damage marker (H2Ax). Flavonoids did not cause DNA-damage in colon-adenocarcinoma-cells at all and counteracted the benzo[a]pyrene-mediated effects. Nevertheless, the flavonoids quercetin and myricetin were able to induce the specific DNA-damage marker (H2Ax) on their own. Apoptosis was only affected by benzo[a]pyrene and not by flavonoids, whereas all flavonoids blocked the benzo[a]pyrene-induced effects. This was shown by the determination of multiple apoptosis-related control parameters like caspase-3-activity, pro-apoptotic protein bax and anti-apoptotic protein bcl-2. For detection of effects on the cell-cycle, several cell cycle-controlling proteins like p21, p27, NFB and phosphorylated retinoblastoma-protein (pRb) were studied and, additionally, direct cell-cycle-analysis was done. In general, benzo[a]pyrene and flavonoids exhibited no effects on cell cycle or cell cycle-associated proteins in colon-adenocarcinoma-cells. But phosphorylation of retinoblastoma-protein (pRb) was induced by benzo[a]pyrene and quercetin significantly. Nevertheless, all flavonoids inhibited benzo[a]pyrene-mediated pRb-phosphorylation. Benzo[a]pyrene and flavnoids were able to affect related signal pathways like MAPK, Nrf2 and AKT, but these effects were not significant in most cases. However, the arylhydrocarbon-receptor-pathway was significantly influenced by benzo[a]pyrene and flavonoids in colon-adenocarcinoma-cells. Benzo[a]pyrene and quercetin caused a strong increase on CYP1A1-mRNA- and protein-level, whereas myricetin and galangin had only a slight inducing effect. The mRNA-level of components of the arylhydrocarbon-receptor-complex were neither influenced by benzo[a]pyrene nor by flavonoids, except for myricetin which caused a significant decrease of AhR and AhR-repressor mRNA-level. Additionally, benzo[a]pyrene and flavonoids strongly increased CYP1A1-activity in colon-adenocarcinoma-cells. Nevertheless, all flavonoids counteracted benzo[a]pyrene-induced CYP1A1-activity. Furthermore, flavonoids directly affected CYP1A1-activity via enzyme-inhibition. More detailled investigations on CYP1A1-inhibition by flavonoids were done using liver microsomes. These experiments had shown, that the inhibition potential of flavonoids decreases with an increasing number of B-ring hydroxyl-groups, while the ability of radical-scavinging decreased in this case. By using an arylhydrocarbon-receptor-inhibitor the AhR-dependency of BaP- and flavonoid-mediated effects on several carcinogenesis-relevant processes was proven. This means that the preventive action of flavonoids and the benzo[a]pyrene-mediated effects are generally dependent on the arylhydrocarbon-receptor-pathway and particularly on the metabolizing enzyme CYP1A1. A final conclusion derived from all experimental data is that flavonoids significantly interfere with BaP-mediated carcinogenesis-relevant processes, i.e. chemically induced carcinogenesis, and therefore appear potentially suitable (effective) for prevention of colon-adenocarcinoma development.

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van Liempt, Manuela: Zusammenwirken des Prokarzinogens Benzo[a]pyren mit pflanzlichen Flavonoiden auf karzinogenese-relevante Prozesse in Kolon-Adenokarzinoma-Zelllinie Caco-2. 2014.

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