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Generation of transgenic mice for the investigation of ceramide metabolism

Knüwer, Martin

Ceramide self-association in cell membranes gives rise to formation of ceramide-rich domains, which in turn reorganize membrane proteins and affect reaction yields of signal transduction pathways. Deregulated ceramide metabolism and membrane organization has been shown in many disease pathologies. The present study aimed to generate transgenic mouse models for the enzymes acid ceramidase and acid sphingomyelinase which both modulate ceramide levels. Genetic mouse models are valuable scientific tools for studying physiological and pathological processes in vivo. In a “gain of function” model, acid ceramidase expression cassettes were introduced into the murine genome. The expression cassette comprised a CAG-promoter driving the transcription of acid ceramidase complementary DNA. Genetic components of the CAG-Asah1 expression cassette were assembled by DNA cloning techniques. Functionality of the construct was tested in vitro proving CAG-Asah1 dependent enhancement of acid ceramidase protein levels and activity. The transgene cassette was delivered to the murine genome by pronuclear injections into fertilized eggs. Transgenic offspring was identified by PCRs and three founder lines were established. The gene dosage of transgene copies in distinct founder lines was determined by quantitative PCR methods. Sphingosine levels of liver, kidney and spleen tissue homogenates were determined by mass spectrometry. The data revealed that tissues of CAG-Asah1 transgenic animals displayed significantly higher levels of the acid ceramidase reaction product in comparison to wild type tissues. The results can be explained by an enhanced catalytic activity of acid ceramidase in CAG-Asah1 animals. In conclusion, my research generated a CAG-Asah1 transgenic mouse model which may reveal important scientific findings with regard to the biological effects resulting from ceramide consumption by acid ceramidase. In an attempt to develop a conditional knockout model, the acid sphingomyelinase gene was targeted with a replacement vector. The design of pPS-Smpd1/KO vector aimed to enable the insertion of loxP recombination sites to the acid sphingomyelinase gene via homologous recombination in embryonic stem cells. The genetic sequences of pPS-Smpd1/KO were assembled by DNA cloning techniques and the completed plasmid reexamined by PCRs and restriction enzyme digests. Recombination competence of the Cre/loxP system was confirmed in E. coli. Subsequently, murine ES cells were transfected with the pPS-Smpd1/KO plasmid DNA. Individual ES cell clones were screened by PCR for homologous recombination events and integration of the targeting construct at the acid sphingomyelinase gene locus. Three ES cell clones were assumed to hold a recombined acid sphingomyelinase gene and were utilized for injection into murine blastocysts. Examination of transgenic animals, however, revealed random and partial integration events of the targeting construct. In this study, knowledge was acquired which allows adapting the targeting construct and/or ES cell screening method to facilitate the generation of the conditional knockout model for the acid sphingomyelinase in the future.

Die Formierung von Ceramid-reichen Domänen in der Zellmembran führt zur Reorganisation von Membranproteinen und beeinflusst somit die Reaktionskinetiken von Signal-übertragungswegen. Störungen des Ceramid-Stoffwechsels und der Membranorganisation sind die Basis vieler Erkrankungen. Die gegenwärtige Studie zielte darauf ab, transgene Mausmodelle für die Enzyme saure Ceramidase und saure Sphingomyelinase zu generieren. Diese Mausmodelle können in der Wissenschaft eingesetzt werden um Veränderungen des Ceramid-Stoffwechsels in vivo zu untersuchen. Zur Generierung einer transgenen Maus wurden Expressionskassetten für die saure Ceramidase in das Mausgenom eingebracht. Diese Expressionskassetten bestehen aus einem CAG-Promoter der die Transkription einer komplementären DNA der sauren Ceramidase reguliert. Die genetischen Komponenten wurden durch DNA Klonierungsmethoden in einem Plasmid verbunden. Die Funktionalität der Expressionskassette wurde in vitro nachgewiesen. Transfizierte Zellen zeigten eine erhöhte Proteinkonzentration und Enzymaktivität der sauren Ceramidase. Durch Pronukleus-Injektion befruchteter Eizellen wurden die Expressionskassetten dann in das Mausgenom eingeführt. Transgene Tiere wurden mittels PCR identifiziert und drei transgene Linien etabliert. Die „Gen-Dosis“ der drei Linien wurde durch quantitativer real-time PCR bestimmt. Sphingosine-Konzentrationen von Leber, Niere und Milz wurden massenspektroskopisch ermittelt. Das Reaktionsprodukt der sauren Ceramidase war signifikant erhöht im Vergleich zu Geweben aus wildtyp Mäusen. Dieses Ergebnis lässt sich erklären mit einer gesteigerten katalytischen Aktivität der sauren Ceramidase in transgenen Tieren. Somit wurde in dieser Studie ein transgenes Maus Model mit einer Überexpression der sauren Ceramidase erzeugt. Diese kann eingesetzt werden um die biologischen Effekte des Ceramid-Abbaus in vivo zu untersuchen. Zur Generierung einer konditionalen Knockout-Maus sollte das saure Sphingomyelinase Gen mit der DNA eines Austauschvektors ersetzt werden. Das Design des pPS-Smpd1/KO Vektors sollte es ermöglichen durch homologe Rekombination loxP-Rekombinationsschnittstellen in das saure Sphingomyelinase Gen von embryonalen Stammzellen einzubringen. Die DNA Sequenz des Plasmids wurde durch Klonierungen zusammengestellt und mittels PCRs und Restriktionsenzymen überprüft. Die Rekombinationskompetenz des Cre/loxP Systems wurde in E. coli verifiziert. Im Anschluss wurden embryonale Stammzellen mit dem Austauschvektor transfiziert. Einzelne ES-Zellklone wurden mittels PCR auf Modifikationen des saure Sphingomyelinase Gens überprüft. Bei drei ES-ZellKlonen wurde ein rekombiniertes Sphingomyelinase Gen festgestellt. ES Zellen dieser Klone wurden in murine Blastozysten injiziert. Untersuchungen der Transgenen Tiere ergaben allerdings, dass der Vektor entweder nur partiell oder an falscher Stelle in das Mausgenom integriert war. Die Erkenntnisse dieser Experimente ermöglichen es den Austauschvektor anzupassen und das ES Zellscreening zu verbessern, um somit das konditionale Knockout-Model in Zukunft zu etablieren.

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Knüwer, Martin: Generation of transgenic mice for the investigation of ceramide metabolism. 2014.

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