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Etablierung eines MYCN-vermittelten murinen Neuroblastommodells und Analyse tumorsuppressiver mikroRNAs

Althoff, Kristina

Das Neuroblastom ist der häufigste solide Tumor des Kindesalters und verantwortlich für ca. 15% aller pädiatrisch-onkologischen Todesfälle. Eine Amplifikation des Onkogens MYCN, durch welche die prognostisch ungünstigste Patientengruppe definiert ist, liegt in 20% aller Neuroblastome vor. Im Rahmen dieser Arbeit wurde ein neues Cre-konditionales MYCN-vermitteltes Mausmodell (LSL-MYCN) entwickelt. Durch die Kreuzung mit Dbh-iCre Mäusen wurde die Expression des MYCN Transgens auf Dopamin-beta-Hydroxylase exprimierende Zellen beschränkt, was zur Entwicklung von Tumoren der Nebennieren, der oberen Zervikalganglien und des Ganglion coeliacum führte. Die Tumore wiesen sowohl die für das Neuroblastom spezifischen kleinen, blauen und runden Zellen als auch neurosekretorische Vesikel auf. Weiterhin konnte eine signifikante Überexpression von humanem MYCN und spezifischer Neuroblastommarker detektiert werden. Genomische Aberrationen sowie mRNA und mikroRNA (miRNA) Expressions-Profile entsprachen denen humaner Neuroblastome. MiRNAs sind kurze, nicht-kodierende RNA Moleküle, die durch Bindung an mRNAs deren Stabilität und Translation regulieren. Die Bedeutung von miRNAs in der Tumorbiologie ergibt sich aus der Regulation von Onkogenen und Tumorsuppressorgenen. In humanen primären Neuroblastomen war die niedrige Expression der miRNAs miR-542-3p und miR-137 mit ungünstiger Prognose assoziiert und eine Herunterregulation von miR-542-3p konnte auch in Tumoren des LSL MYCN;Dbh-iCre Modells beobachtet werden. Die Funktion beider miRNAs wurde in vitro in präklinischen Modellsystemen des humanen Neuroblastoms detailliert untersucht. Die ektope Expression der miRNAs reduzierte die Zellviabilität und Proliferation, erhöhte die Apoptoserate und induzierte einen Zellzyklusarrest. Weiterhin wurde die direkte Bindung der vorhergesagten Ziel-mRNAs KDM1A (miR-137) und Survivin (miR-542-3p) mittels Luziferase Reporter Analysen validiert und die Regulation sowohl auf mRNA- als auch auf Proteinebene verifiziert. Die Herunterregulation der Zielgene in Neuroblastomzellen stellte eine Phänokopie der Effekte einer exogenen Expression der jeweiligen miRNA dar. Die Spezifität der miRNA-vermittelten Regulation wurde durch ektope Expression des Zielgens mit mutierter miRNA-Bindestelle nachgewiesen. Eine Therapiesimulation in Neuroblastom-Xenografts mit miR-542-3p-beladenen Nanopartikeln zeigte sowohl eine Herunterregulation des Zielproteins Survivin als auch eine Reduktion der Proliferation und Erhöhung der Apoptoserate in den Tumorzellen. Die Etablierung des neuen LSL-MYCN;Dbh-iCre Neuroblastom-Mausmodells kann dabei helfen sowohl die Pathogenese des Neuroblastoms besser zu verstehen als auch potentiell Neuroblastom-relevante Gene und miRNAs zu identifizieren. Eine Weiterentwicklung dieses Modells durch Kombination mit anderen Mausmodellen, die potentiell Neuroblastom-relevante Gene regulieren, könnte im Zusammenspiel mit neuen Behand¬lungsstrategien Einblicke in die Wirksamkeit von künftigen Neuroblastomtherapien geben. Die Behandlung humaner Neuroblastompatienten mit tumorsuppressiven miRNAs, wie miR-542-3p und miR-137, könnte ein möglicher Ansatz sein den aggressiven Verlauf dieser Erkrankung zu reduzieren.

Neuroblastoma is a common solid tumor of infancy and accounts for more than 15% of pediatric cancer deaths. Amplification of MYCN oncogene defines the most aggressive subtype of neuroblastoma with poor prognosis. In the present study, a new Cre-conditional MYCN-driven transgenic mouse model was generated to analyse tumorigenesis in vivo. When targeting MYCN expression to the neural crest in transgenic LSL-MYCN;Dbh-iCre mice, palpable tumors developed, which arose predominantly from both adrenals, but also from superior cervical ganglia and ganglion coeliacum. LSL MYCN;Dbh-iCre-induced tumors consisted of small round blue cells and possessed neurosecretory vesicles. Expression of human MYCN and specific neuroblastoma marker genes was high in tumors. Furthermore, murine neuroblastomas recapitulated genomic aberrations and MYCN mRNA as well as microRNA (miRNA) signatures described for human neuroblastoma. MiRNAs are small noncoding RNA molecules that bind target mRNAs resulting in translational repression or degradation of the mRNA. In cancer, they can act as tumor suppressors or oncogenes. In human primary neuroblastomas, low expression of miR-542-p and miR-137 was highly correlated with unfavourable prognosis and miR-542-3p was upregulated in murine LSL MYCN;Dbh-iCre tumors. Exogenous expression of these miRNAs in established neuroblastoma cell lines reduced viability and proliferation, increased apoptosis and induced cell cycle arrest. Furthermore, direct interaction be¬tween the predicted targets survivin (miR-542-3p) and KDM1A (miR-137) was validated by luciferase reporter assays and regulation was demonstrated on mRNA as well as protein level. Ectopic expression of miR-542-3p or miR-137 phenocopied the knock¬down of respective targets. In addition, we were able to validate a direct interaction between miRNAs and their targets by performing rescue experiments. Treatment of mice bearing neuroblastoma xenografts with miR-542-3p-loaded nanoparticles resulted in downregulation of survivin and induced reduced tumor cell proliferation as well as increased apoptosis. In conclusion, the novel LSL MYCN;Dbh-iCre neuroblastoma mouse model contribute to a better understanding of MYCN-driven neuroblastoma and to identification of relevant genes and miRNAs. Combination with other transgenic models, regulating potential relevant genes, could provide new insights into neuroblastoma tumorigenesis. Restoring function of tumor suppressive miRNAs, such as miR-542-3p or miR-137, could represent a feasible approach to reduce neuroblastoma aggressiveness.

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Althoff, Kristina: Etablierung eines MYCN-vermittelten murinen Neuroblastommodells und Analyse tumorsuppressiver mikroRNAs. 2014.

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