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Variation in mitochondrial genes in obesity

Knoll, Nadja

In 2008, more than 35 % of the world’s adult population were overweight (BMI ≥ 25 kg/m^2) and 11 % were obese (BMI ≥ 30 kg/m^2). Although in the last five to ten years a stabilizing trend in prevalence had been observed, obesity still is a major global health problem, because of health consequences in later life such as type 2 diabetes mellitus (T2DM). Both environmental and genetic factors were shown to contribute to the global obesity epidemic. In empirical studies, the heritability of the BMI variance was estimated to 40 % to 70 %. Interestingly, larger correlations in BMI between mothers and their offspring than between fathers and their offspring were found. Mitochondria are well known as cellular power plants and contain an exclusively maternally inherited circular DNA (mtDNA) of 16,569 bp with 37 genes of which 13 are protein coding subunits of the oxidative phosphorylation system (OXPHOS). On the other hand, ~1,000 to 1,500 nuclear-encoded genes are required to maintain mitochondrial biogenesis. Alterations in mitochondrial function were found in obese individuals. Both variation of mtDNA and nuclear-encoded mitochondrial genes have been analyzed in association with obesity within the present PhD thesis, because of (1) the central role of mitochondria in the energy metabolism, (2) hints of altered mitochondrial function in obese individuals, and (3) the parental effect of correlations in BMI to which genetic variation in the exclusively maternally inherited mtDNA might contribute. For analysis of variation in mtDNA, first of all, an association study of up to 40 array-based SNPs of mtDNA (all but one of the SNPs located in mtDNA coding region) was performed in a case-control (CC) sample of 1,158 (extremely) obese cases and 435 lean adult controls (discovery). SNPs were analyzed as single SNPs and as haplogroups determined by HaploGrep. Analysis was done (a) in all individuals and (b) stratified by gender. For independent confirmation, nominally associated SNPs were followed-up among adults of three population-based samples analyzed as CC sample of 1,697 obese cases and 2,373 normal weight controls. In addition, the mtDNA control region (D-loop) of each 192 cases and controls was screened for variants by re-sequencing (Sanger). Fisher’s two-sided exact test was used for association testing. Five SNPs (m.4769A/G, m.8994G/A, m.11674C/T, m.12612A/G and m.13708G/A) and two haplogroups (W, J) were initially found to be nominally associated with obesity (a) in the whole sample (m.8994G/A, W) or (b) stratified by gender, but none of these SNPs or haplogroups could be confirmed in the independent sample. By re-sequencing, 252 variants were detected. Frequencies of two of these variants differed nominally between cases and controls (m.16189T/C, m.16292C/T). m.16189C was more frequent among the cases (17 % vs. 9 %; p=0.048), while 16292T was only found in eight controls. For analysis of nuclear-encoded mitochondrial genes, a gene set enrichment analysis (GSEA) was performed using three gene sets previously investigated in association with T2DM: (1) 16 nuclear-encoded regulators of mitochondrial genes, (2) 91 OXPHOS genes, and (3) 966 nuclear-encoded human mitochondrial genes. For discovery, GSEA was performed in a CC sample of 453 (extremely) obese cases and 435 lean adult. Independent confirmation occurred in a family-based sample of 705 obesity trios and an adult population-based analyzed as a CC sample (463 obese cases and 483 normal weight controls, KORA-CC). A meta-analysis of all three samples was performed. The distribution of association signals (i.e. gene-wise corrected p-values Pg) between a gene set and the gene set of all genes was compared using a leading-edge-fraction-comparison test with cut-offs between the 50th and the 95th percentile in the set of all Pg and alternative tests (e.g. Wilcoxon-Mann-Whitney-test). In the discovery, gene set 1 was significantly enriched for modest to weak association signals above the 50th percentile (pGSEA,50=0.0103). This enrichment was not confirmed in the trios, but in KORA-CC. In the meta-analysis, enrichment was not detected above the 50th percentile, but above the 75th. In conclusion, analysis of up to 40 array-based common mtDNA SNPs did not lead to robust association of either a single mtDNA SNP or a haplogroup. Pertaining to D-loop variants, m.16189T/C seems to be promising to be followed-up in a further sample for independent confirmation of the initial association. The results of variant m.16292C/T, by contrast, might be rather spurious as five of the eight controls carrying the variant allele T were of haplogroup W, association of which could not be independently confirmed. Regarding nuclear-encoded mitochondrial genes, GSEA revealed that modest to weak association signals for obesity might be enriched in the gene set of 16 nuclear-encoded regulators of mitochondrial genes. Although the impact is small, the results of the present thesis contribute to elucidate the heritability of the BMI variance on a molecular genetic level.

Nach Angaben der WHO, waren im Jahre 2008 mehr als 35 % aller Erwachsenen übergewichtig (BMI ≥ 25 kg/m^2) und 11 % adipös (BMI ≥ 30 kg/m^2). Obwohl in den letzten fünf bis zehn Jahren ein stabilisierender Trend in der Prävalenz zu verzeichnen war, stellt Adipositas wegen gesundheitlicher Konsequenzen im späteren Leben wie z.B. Type 2 Diabetes Mellitus (T2DM) immer noch ein globales Gesundheitsproblem dar. Sowohl Umwelt- als auch genetische Faktoren sind für die globale Adipositasepidemie verantwortlich. In empirischen Studien wurde die Erblichkeit der Varianz des BMI auf 40 % bis 70 % geschätzt. Interessanterweise wurden größere Korrelationen zwischen mütterlichem und kindlichem BMI, als zwischen väterlichem und kindlichem gefunden. Mitochondrien sind als Kraftwerke der Zelle bekannt und besitzen eine ausschließlich mütterlich vererbte zirkuläre DNA (mtDNA) von 16.569 bp. Diese kodiert 37 Gene; 13 dieser Gene stellen proteinkodierende Untereinheiten des oxidativen Phosphorylierungssystems (OXPHOS) dar. Auf der anderen Seite werden ~1.000 bis 1.500 kernkodierte Gene benötigt, um die mitochondriale Biogenese aufrechtzuerhalten. Änderungen der mitochondrialen Funktion wurden in ädipösen Individuen gefunden. Im Rahmen dieser Doktorarbeit wurden Variationen in der mtDNA sowie in kernkodierten mitochondrialen Genen in Assoziation mit Adipositas analysiert, aufgrund (1) der zentralen Rolle der Mitochondrien im Energiemetabolismus, (2) von Hinweisen auf eine veränderte mitochondriale Funktion bei Adipösen und (3) des elterlichen Effekts höherer mütterlicher-kindlicher BMI Korrelationen, zu diesem genetische Variationen der ausschließlich mütterlich vererbten mtDNA beitragen könnten. Zur Analyse der Variation in der mtDNA wurde zunächst eine Assoziationsstudie von bis zu 40 chipbasierten mtDNA SNPs (welche bis auf einen in der kodierenden Region der mtDNA zu finden sind) in einem Fall-Kontroll-Kollektiv von 1.158 (extrem-) adipösen Kindern und Jugendlichen und 435 schlanken erwachsenen Kontrollen durchgeführt. Die SNPs wurden als einzelne SNPs und Haplogruppen, welche mittels HaploGrep bestimmt wurden, analysiert. Die Analysen wurden (a) in allen Individuen und (b) geschlechtsgetrennt durchgeführt. Zur unabhängigen Bestätigung wurden nominal assoziierte SNPs in Erwachsenen aus drei populationsbasierten Kohorten weiterverfolgt, wobei nur die insgesamt 1.697 adipösen Fälle den 2.373 normalgewichtigen Kontrollen gegenübergestellt wurden. Zur Identifizierung weiterer Varianten wurde die mitochondriale Kontrollregion (D-loop) von je 192 Fällen und Kontrollen re-sequenziert (Sanger). Ein zwei-seitiger exakter Fisher Test wurde als Assoziationstest verwendet. Fünf SNPs (m.4769A/G, m.8994G/A, m.11674C/T, m.12612A/G und m.13708G/A) und zwei Haplogruppen (W, J) waren initial nominal mit Adipositas (a) in allen Individuen (m.8994G/A, W) oder (b) geschlechtsgetrennt assoziiert. Jedoch konnte keiner dieser SNPs bzw. Haplogruppen im unabhängigen Kollektiv bestätigt werden. Durch Re-Sequenzierung wurden 252 Varianten gefunden. Die Frequenzen zweier Varianten unterschieden sich nominal zwischen Fällen und Kontrollen (m.16189T/C, m.16292C/T). m.16189T/C war häufiger in den Fällen (17 % vs. 9 %; p=0,048), wohingegen 16292T nur in acht Kontrollen zu finden war. Zur Analyse der kernkodierten mitochondrialen Gene wurde eine „gene set enrichment analysis“ (GSEA) durchgeführt und drei Gensets, die im Vorfeld in Assoziation mit T2DM analysiert wurden, verwendet: (1) 16 kernkodierte Regulatoren der mitochondrialen Gene, (2) 91 OXPHOS Gene und (3) 966 kernkodierte mitochondriale Gene. Im Discovery-Schritt wurde eine GSEA in einem Fall-Kontroll-Kollektiv von 453 (extrem-) adipösen Kindern und Jugendlichen und 435 schlanken erwachsenen Kontrollen durchgeführt. Zur unabhängigen Bestätigung wurden 705 Adipositastrios sowie ein populationsbasiertes Erwachsenenkollektiv, welches als Fall-Kontroll-Kollektiv analysiert wurde (463 adipöse Fälle vs. 483 normalgewichtige Kontrollen, KORA-CC), verwendet. Zudem wurde eine Metaanalyse aus allen drei Kollektiven durchgeführt. Die Verteilung der Assoziationssignale (d.h. Gen-korrigierte p-Werte Pg) zwischen einem Gensets und dem Genset aller Gene wurden mittels leading-edge-fraction-comparison Test verglichen. Dafür wurden Cut-offs zwischen der 50. und 75. Perzentile des Sets aller Pg verwendet. Zudem wurden alternative Tests wie z.B. der Wilcoxon-Mann-Whitney-Test durchgeführt. Im Discovery-Schritt war Genset 1 signifikant für moderate bis schwache Assoziationssignale oberhalb der 50. Perzentile angereichert (pGSEA,50=0.0103). Diese Anreicherung wurde nicht in den Adipositastrios bestätigt, jedoch in KORA-CC. In der Metaanalyse wurde keine Anreicherung oberhalb der 50., jedoch oberhalb der 75. Perzentile gefunden. Schlussfolgernd lässt sich sagen, dass bei der Analyse der bis zu 40 Chipbasierten häufigen mtDNA SNPs weder ein einzelner SNP noch eine Haplogruppe robust mit Adipositas assoziiert war. Bezüglich der D-loop SNPs erscheint m.16189T/C vielversprechend, in einem unabhängigen Kollektiv weiterverfolgt zu werden, wohingegen m.16292C/T eher falsch positiv sein könnte, da fünf der acht Träger des T-Allels zur Haplogruppe W gehörten, deren Assoziation nicht unabhängig bestätigt werden konnte. Im Hinblick auf die kernkodierten mitochondrialen Gene konnten im Genset der 16 kernkodierten Regulatoren der mitochondrialen Gene durch eine GSEA eine Anreicherung moderater bis schwacher Assoziationssignale ermittelt werden. Die Ergebnisse der vorliegenden Doktorarbeit liefern zwar nur einen kleinen Beitrag, tragen jedoch dazu bei, die Erblichkeit der Varianz des BMI auf molekulargentischer Ebene zu entschlüsseln.

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Knoll, Nadja: Variation in mitochondrial genes in obesity. 2013.

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