DuEPublico 2

Dies ist unser neues Repositorium, derzeit für E-Dissertationen und ausgewählte weitere Publikationen. Weitere Informationen...

Antikörper-selektive Polymere zur Reinigung von medizinischem Immunglobulin G

Latza, Patricia

Hauptaufgabe dieser Arbeit war es, aufbauend auf Aminosäure-spezifischen bzw. epitop-spezifischen Haftmonomeren, durch Variation der Comonomer-Zusammensetzung lineare Polymere zu erzeugen, welche in Wasser oder Puffer IgG selektiv erkennen und im nanomolarem Bereich binden können. Zur Auswahl der Haftmonomere diente die Kristallstruktur des Protein A/IgG Interfaces als Grundlage, um epitop-spezifische Affinitätspolymere zu designen. Auf diese Weise entstand eine kombinatorische Bibliothek von maßgeschneiderten höheren Polymeren, welche mittels ELISA- Technik und Fluoreszenztitration auf IgG-Affinität getestet wurde. Das beste Affinitätspolymer wurde auf einer festen Phase immobilisiert und konnte im Anschluss erfolgreich im Capture-Schritt eingesetzt werden. Die oben beschriebene Aufgabenstellung zerfällt in zwei Zielsetzungen: a) die Entwicklung einer großen Zahl an Haftmonomeren mit hoher Spezifität für bestimmte Aminosäure-Seitenketten und ihr Einsatz im Epitop- und Protein-Imprinting sowie in der Herstellung von Membranabsorbern; b) die Entwicklung von antikörperselektiven Affinitätspolymeren mit Hilfe dieser Haftmonomere, und ihre Immobilisierung auf einem geeigneten Trägermaterial für die Anwendung im Capture-Schritt. Das erste Ziel wurde erreicht, indem bekannte und neue Bindungsmotive für proteinogene Aminosäuren aus dem Bereich der supramolekularen Chemie in Methacrylamide überführt wurden, gereinigt wurden und nach Abspaltung etwaiger Schutzgruppen in DMF- bzw- wasserlöslicher Form unter Kühlung gelagert und bei Bedarf geliefert wurden. Neben aminosäure-selektiven wurden im Laufe des Projektes auch epitopspezifische Haftmonomere entwickelt. Das zweite Ziel wurde erreicht, indem die Kristallstruktur des Protein A/IgG-Interfaces gründlich studiert wurde. Eine Analyse der für die molekulare Erkennung kritischen Aminosäurereste und ihrer Verteilung auf und um die Protein A-Bindungsstelle führte zur Auswahl bzw. Neusynthese von geeigneten Haftmonomeren. Durch systematische Variation der Polymerisierungsbedingungen wurde eine Methode zur Copolymerisation im Mikro- (10-50 mg) und Minimaßstab (50-500 mg) entwickelt, die in DFM-Wasser-Gemischen mit hohen Ausbeuten abläuft. Mit ihrer Hilfe wurde eine diversifizierte Bibliothek an Copolymeren synthetisiert und hinsichtlich ihrer IgG-Affinität getestet. Dafür wurde ein neuer kompetitiver ELISA-Test entwickelt, der sämtliche Polymere hinsichtlich ihrer Affinität zur Protein A-Bindungsstelle auf dem IL-8-spezifischen Immunglobulin quantifizieren konnte und durch separate Fluoreszenz-Titrationen bestätigt wurde. Das beste Affinitätspolymer wurde auf einer festen Phase immobilisiert und konnte im Anschluss erfolgreich im Capture-Schritt eingesetzt werden.

Recognition of protein surfaces using synthetic receptors is an effective strategy for regulating protein-protein interactions. The ability of polymers to adapt their conformations to protein surfaces renders them attractive candidates for protein surface binding. Rational design in combination with a screening process is used to develop affinity polymers for a specific binding site on the surface of immuneglobuline G proteins. The concept starts with the identification of critical amino acid residues on the protein interface and their topological arrangement. Appropriate binding monomers are subsequently synthesized. By copolymerization, a flexible copolymer is produced that is capable of performing an extensive “induced-fit” procedure on top of the respective protein surface, and therefore reaching maximal attractive (non)covalent interactions. To prepare a linear polymer library with different functional monomers tailored for different amino acids, methylacrylamide based monomers were polymerized by radical polymerization in organic solvent or aqueous solution under 70°C, with AIBN as initiator. After preparation the polymers were purified by ultrafiltration using a 3 kDa cut-off membrane to obtain highly fluorescent powders with good water solubility and with no remains of monomers. They could be characterized by 1H and 13 C NMR. Their molecular weights could be obtained by GPC measurements (standards: pullulan, polyethylene glycol). In a competitive ELISA screen of the polymer libraries (20-50 members), few copolymers qualified as strong and selective binders for the potein A binding site on the antibody’s Fc fragment. Their monomer composition precisely reflected the critical amino acids found at the interface. Already the combination of a charged and a nonpolar binding monomer sufficed for selective submicromolar IgG recognition by the synthetic polymer. Affinities were confirmed by fluorescence titrations; they increased with decreasing salt load, but remained largely unaltered at lowered pH. Other proteins, including those of similar size and pI were bound 10-1000 times less tightly. This example indicates, that interaction domains in other proteins may also be targeted by synthetic polymers, if their comonomer composition reflects the nature and arrangement of amino acid residues on the protein surface.

Teilen und Zitieren

Zitierform:

Latza, Patricia: Antikörper-selektive Polymere zur Reinigung von medizinischem Immunglobulin G. 2013.

Rechte

Nutzung und Vervielfältigung:
Alle Rechte vorbehalten

Export