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Homing Endonuklease basierende Model-Systeme zur Untersuchung der DNA-Doppelstrangbruch induzierten Signalwege und Reparatur

Schipler, Agnes

In Zellen, die ionisierender Strahlung ausgesetzt sind, werden aufgrund der speziellen Energiedeposition entlang der Bahnstruktur der ionisierenden Partikel, welche häufig zu multiplen Ionizationen in einem kleinen Volumen führen, geclusterte DNA-Schäden induziert. Es wird angenommen, dass die Prozessierung von geclusterten DNA-Schäden, welche sowohl chemische Basenveränderungen als auch DNA-Strangbrüche umfassen, die sich auf beiden Strängen einer DNA-Windung erstrecken, fehlerhaft abläuft und zur genomischen Instabilität und dem damit verbundenen Zelltod führen kann. Im Gegensatz dazu werden DNA-Schäden, welche isoliert auftreten, von speziellen Reparaturmechanismen fehlerfrei repariert. Eine spezielle Form von geclusterten DNA-Schäden auf Chromatin-Ebene stellen DSB da, die nah beieinander in der DNA induziert werden. Durch das Clustern von DSBs in Abständen von einigen hundert bis einigen tausend bp können instabile Chromosomen-Fragmente generiert werden, die Deletionen verursachen und somit zum Verlust der genomischen Integrität führen. Es existieren theoretische Berechnungen, welche die Induktion von geclusterten DSBs modellieren. Die biologische Relevanz von geclustereten DSBs kann aber nicht getestet werden, da die kontrollierte Induktion von DSBs mittels IR nicht möglich ist. Im Rahmen dieser Arbeit wurde ein auf der Homing Endonuclease I-SceI basierendes Modellsystem entwickelt, um geclusterte DSBs mit definierten Abständen in der zellulären DNA zu induzieren und anschließend deren biologischen Folgen zu untersuchen. Mithilfe der Transposontechnologie wurden die I-SceI Konstrukte sowohl an verschiedenen Stellen in das Genom von CHO wt Zellen, als auch in den Zelllinien XR-C1-3, Xrs6 und irs1SF, welche inaktivierende Mutationen in Proteinen wichtiger Reparaturwege aufweisen, integriert, um den Einfluss der unterschiedlichen Reparaturwege auf geclusterte DSBs untersuchen zu können. Die Anzahl der Integrationsstellen und somit auch die Anzahl der möglichen Doppelstrangbrüche wurde anhand von Southern Blotting ermittelt. Mit Hilfe dieser Model-Systeme ist die gleichzeitige Induktion von geclusterten DSBs durch die Transfektion von I-SceI exprimierenden Plasmiden möglich, welche die Ereignisse nach Bestrahlung mit ionisierender Strahlung in einer Zelle imitieren. Überlebensexperimente mit diesen Zelllinien haben gezeigt, dass durch I-SceI induzierte geclusterte DSBs im Gegensatz zu simplen DSBs, zu einem starken Absterben führen. In Übereinstimmung mit dem hohen Tötungspotential von geclusterten DSBs konnte anhand von Chromosomen-Aberrationen fehlerhafte Reparatur nachgewiesen werden. Weiterhin konnte anhand von Lebend-Zell-Experimenten gezeigt werden, dass die Foci-Bildung von 53BP1 Unterschiede zwischen simplen und geclusterten DSBs aufweist. Diese Ergebnisse weisen auf eine Verbindungen zwischen der Komplexität des DSBs und der Entwicklung einer zellulären Antwort auf DNA Schäden hin.

In cells exposed to ionizing radiation (IR) energy deposition events in the form of ionization clusters induce clustered damages in the DNA. The processing of clustered DNA damage is likely to be different from that of the constituent lesions when induced in isolation, and possibly error-prone. The prevalent view in the field is that base lesions and breaks clustered within one or two DNA helical turns impair processing, not only of the secondarily induced DSBs, but also of themselves causing mutations or cell death. A special form of clustered DNA damage, which received attention in the past but is presently only rarely studied, is two DSBs induced in close proximity on the DNA molecule. Such clustering of DSBs at distances between a few hundred to a few thousand base pairs is likely to generate unstable chromatin fragments highly prone to loss, which may locally destabilize the genome and initiate adverse biological consequences. Although IR is known to generate this potentially highly-dangerous form of DNA damage, study of its biological relevance is hampered by difficulties to induce it in a controlled manner. This leaves theoretical modeling as the only approach for estimating its induction, but still without offering means for analyzing its effects. In an attempt to close this gap we used advanced biological approaches to model DSB clustering and test its biological consequences. Therefore cell lines in which simple DSBs and DSB-clusters can be induced in the genome by restriction of I-SceI sites engineered at defined distances in the DNA were developed. For this purpose, constructs carrying one, two or four I-SceI sites, placed at precisely defined distances to model increased clustering of DSBs, were randomly integrated in the genome using the Sleeping Beauty transposon technology. This thesis presents results obtained with clonal cell lines generated from wild type CHO cells, as well as from CHO mutants which are deficient in HR (irs1SF) or NHEJ (Xrs6, XR-C1-3). Before use for experiments, each clone is characterized for the number of construct integrations by Southern blotting, which provides the maximum number of complex DSBs that can be induced upon transfection with I-SceI. Performing cell survival experiments by colony formation, we could show that CHO clones with high number of integrations undergo extensive killing after induction of DSBs by I-SceI that is proportional to lesion complexity. In accordance with the strong killing observed in survival experiments the probability for misrepair measured by G2-PCC is clearly elevated for DSB clusters, showing that clustered DSBs have a high risk for the formation of chromosomal aberrations. Furthermore life cell imaging of 53BP1 foci revealed differences in signaling characteristics for different levels of DSB complexity unraveling unexpected activation characteristics of the DNA damage response that require further investigations.

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Schipler, Agnes: Homing Endonuklease basierende Model-Systeme zur Untersuchung der DNA-Doppelstrangbruch induzierten Signalwege und Reparatur. 2013.

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