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Sulfur oxidation in moderately thermophilic leaching bacteria

Janosch, Claudia

Control of sulfur compound oxidation in the moderately and extremely thermophilic range is of importance in bioleaching operations for the industrial winning of heavy metals. Consequently, knowledge of the biochemistry of sulfur oxidation is required for inhibition as well as enhancement in bioleaching operations. In this work, the sulfur oxidation pathways of the leaching strains Acidithiobacillus caldus and the Sulfobacillus thermosulfidooxidans were investigated. Several energy sources for At. caldus were used. It grew best on elemental sulfur (S0) compared to thiosulfate and tetrathionate at 45 °C. Several genes have been proposed to be involved in sulfur oxidation in At. caldus. The expression levels of six of them, sor (ACA_0302), soxB (ACA_2394), soxX (ACA_2389), sqr_I (ACA_0303), sqr_II (ACA_2485) and tth (ACA_1633), were measured under different growth conditions in order to find out whether there is a differential regulation depending on the substrate and temperature. Additionally, the sox_I cluster (ACA_2389-ACA_2394) of At. caldus was analyzed for cotranscription in order to demonstrate its potential gene organization in an operon. A big part of this thesis included a high throughput proteomic analysis of elemental sulfur (S0) and thiosulfate grown cells of At. caldus. A total number of 1292 proteins (45.8 %) was identified from 2821 protein encoding genes annotated in the genome of At. caldus type strain DSM 8584T. 1215 proteins were detected in S0 grown bacteria and 1120 proteins were detected in thiosulfate grown bacteria. 85 proteins were found to be induced in S0, while 13 proteins were found to be induced in thiosulfate grown bacteria. All proteins were classified according to COG categories. The proteins involved in the sulfur and carbon metabolism, respiratory complexes, EPS production and cell mobilization (pili) were deeply analyzed. Apart from sulfur oxygenase reductase (Sor) all proteins involved in sulfur metabolism were found in the proteomes. The rhodanese (ACA_2397) in one heterodisulofide reductase (Hdr) cluster was up-regulated on S0, and the tetrathionate hydrolase (Tth) was up-regulated on thiosulfate grown At. caldus cells. The sor gene was screened via PCR in different At. caldus strains with degenerated primers designed for the bacterial sor branch. Sor genes were found to be present in almost all At. caldus strains. Furthermore, the enzymatic activity of Sor and a putative sulfur dioxygenase (Sdo) were analysed in crude extracts for the strains At. caldus DSM 8584T, At. caldus C-SH12 (DSM 9466), the At. caldus-like isolates MNG, f, and Sb. thermosulfidooxidans DSM 9293T. Here, the comparison of enzymatic assays with (Sdo) and without (Sor) addition of an external thiol groups (provided by GSH) were performed. The sulfide formation was quantified as indicator for Sor activity, which could not be measured in any of the At. caldus strains analyzed. However, the type strain of Sb. thermosulfidooxidans Sor showed an oxygenase activity of 1.2 U/mg and a reductase activity of 77 mU/mg at 75 °C at the optimum pH 7.5. Recently, the whole genome of Sb. thermosulfidooxidans DSM 9293T was sequenced. The At. caldus aa sequences were used for searching homologues proteins probably involved in sulfur oxidation. Interestingly, two genes encoding Sor and one HDR cluster (Sulth_1021-Sulth_1026) were found. DoxD and 3 putative tth genes could also be identified. Contrary to At. caldus, doxD and tth were not found clustered together in Sb. thermosulfidooxidans. Furthermore, one putative cluster of anaerobic dimethyl sulfoxide reductase dsrABC and dsrEFH-like (Sulth_2366-Sulth_2369) was identified. Interestingly, no genes encoding Sox proteins were found.

Die Kontrolle von der Oxidation von Schwefelverbindungen im gemäßigt und extreme thermophilen Bereich in Biolaugungsprozessen ist wichtig um industriell Schwermetalle zu gewinnen. Folglich sind Kenntnisse der Biochemie der Schwefeloxidation für die Hemmung sowie für die Verbesserung in den Biolaugungsprozessen erforderlich. In dieser Arbeit wurden die schwefeloxidierenden Metabolismus-Pfade von Acidithiobacillus caldus und Sulfobacillus thermosulfidooxidans untersucht. Mehrere Energiequellen wurden für At. caldus verwendet. Das Bakterium ist am besten auf dem Elementarschwefel (S0) im Vergleich zu Thiosulfat und Tetrathionat bei 45 °C gewachsen. Mehrere Gene sind vorgeschlagen worden, die an der Schwefeloxidation in At. caldus mit beteiligt sind. Die Expressions-Niveaus von sechs Genen, sor (ACA_0302), soxB (ACA_2394), soxX (ACA_2389), sqr_I (ACA_0303), sqr_II (ACA_2485) und tth (ACA_1633), wurden unter verschiedenen Wachstumsbedingungen gemessen. Es sollte herausgefunden werden, ob es eine Differenzialregulierung abhängig vom Substrat und der Temperatur gibt. Zusätzlich, wurde das sox_I Cluster (ACA_2389-ACA_2394) in At. caldus auf Ko-Transkription analysiert, um seine potenzielle Genorganisation in einem Operon zu demonstrieren. Ein großer Teil dieser Arbeit hat eine High Throughput Proteomik Analyse von At. caldus Zellen ausgemacht, welche entweder auf Elementarschwefel (S0) oder Thiosulfat angewachsen wurden. Eine Gesamtzahl von 1292 Proteinen (45.8 %) wurde von 2821 annotierten Proteinen im Genom des At. caldus-Typstamm DSM 8584T identifiziert. 1215 Proteine wurden in S0 gewachsene Bakterien entdeckt und 1120 Proteine wurden in Thiosulfat gewachsene Bakterien identifiziert. Es konnte gefunden werden, dass 85 Proteine in S0 induziert wurden und 13 Proteine in Thiosulfat gewachsene Bakterien induziert wurden. Alle Proteine wurden gemäß COG (Clusters of Ortholog Groups)-Kategorien klassifiziert. Die Proteine, die am Schwefel- und dem Kohlenstoff-Metabolismus, der Atmungskette, der EPS Produktion und der Zellmobilisierung (Pili) beteiligt sind, wurden vertieft analysiert. Abgesehen von der sulfur oxygenase reductase (Sor) wurden alle im Schwefel-Metabolismus beteiligten Proteine in den Proteomen gefunden. Die Rhodanase (ACA_2397) in einem der Heterodisulofide reductase (Hdr) Cluster ist auf S0 gewachsenen At. caldus Zellen up-reguliert, und die Tetrathionate Hydrolase (Tth) ist auf Thiosulfate gewachsenen Zellen up-reguliert. Das sor Gen wurde über PCR im verschiedenen At. caldus Stämmem untersucht. Hierfür wurden degenerierte Primer entwickelt, die besonders gut in den sor Bakterienzweig passten. Es stellte sich heraus, dass sor Gene in fast allen At. caldus Stämmen zu finden sind. Außerdem wurde die enzymatische Aktivität von Sor und einer vermeintlicher Schwefel Dioxygenase (Sdo) in Rohextrakten für die Stämme At. caldus DSM 8584T, At. caldus C-SH12 (DSM 9466), At. caldus-ähnlich MNG, f, und Sb. thermosulfidooxidans DSM 9293T analysiert. Hierfür wurden enzymatischen Vergleiche mit der Zugabe (Sdo) und ohne (Sor) von Thiol-Gruppen (hinzugefügt in Form von GSH) durchgeführt. Die Sulfid-Bildung wurde als Hinweis für die Tätigkeit von Sor gemessen. Diese konnte in keinem At. caldus Stamm gemessen werden. Jedoch hat der Typstamm von Sb. thermosulfidooxidans eine Sor Oxygenase Aktivität von 1.2 U/mg und eine Reduktase Aktivität von 77 mU/mg bei 75 °C bei optimalen dem pH Wert von 7.5 gezeigt. Kürzlich wurde das gesamte Genom von Sb. thermosulfidooxidans DSM 9293T sequenziert. Die amino acid (aa) Sequenz von At. caldus Proteinen wurde hierbei verwendet, um nach homologen Schwefel-oxidierenden Proteinen in Sb. thermossulfidooxidans zu suchen. Interessanterweise wurden jeweils zwei Gene für sor und eine hdr Clusters (Sulth_1021-Sulth_1026) gefunden. DoxD und 3 vermeintliche tth Gene konnten auch identifiziert werden. Die Gruppierung von doxD und tth in At. caldus konnte in Sb. thermosulfidooxidans nicht gefunden werden. Außerdem wurden vermeintliche Cluster von anaerobic dimethyl sulfoxide reductase dsrABC und dsrEFH-ähnlich (Sulth_2366-Sulth_2369) identifiziert. Interessanterweise wurden keine Gene, die Sox-Proteine kodieren, gefunden.

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Janosch, Claudia: Sulfur oxidation in moderately thermophilic leaching bacteria. 2013.

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