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Characterisation of apoptosis-stimulating p53 binding protein 2 (ASPP2) as a new substrate for asparaginyl hydroxylation

Janke, Kirsten

Hydroxylation by Fe(II)- and 2-oxoglutarate-dependent dioxygenases is increasingly recognised as an important protein modification. FIH-1-dependent hydroxylation of HIF-α subunits has previously been shown to influence the interaction of this protein with important transcriptional co-activators thereby modulating HIF transcriptional activity. Recently, another substrate group could be identified for FIH-1. All substrates of this new group are hydroxylated within a highly conserved protein interaction domain, the ankyrin repeat domain (ARD). In our study, we identified a single hydroxylation site for FIH-1 within the ARD of apoptosis-stimulating p53 binding protein 2 (ASPP2), N986, in vitro and in cells. In contrast, the highly conserved family member inhibitory ASPP (iASPP) was not hydroxylated by FIH-1 at the corresponding asparagine in vitro revealing distinct characteristics required for the hydroxylation site despite rather low substrate specificity previously reported for FIH-1. Physiologic effects of ASPP2 hydroxylation were studied in cancer cells depleted of FIH-1 by lentiviral transduction. Interestingly, p53-dependent apoptosis which has previously been shown to be modulated by ASPP2 as well as the interaction between p53 and ASPP2 were not affected by silencing of FIH-1. In general, a role for endogenous ASPP2 in the induction of chemotherapy-induced apoptosis could not be confirmed using wild-type p53 cancer cells. In addition, neither proliferation nor adhesion or migration were affected substantially upon FIH-1 depletion. In contrast, the interaction of ASPP2 with the tight junction protein partitioning defective 3 homolog (Par-3) was impaired upon suppression of FIH-1. This interaction was previously found important for the regulation of polarity and proliferation of neuronal progenitor cells in vivo and for the formation and maintenance of tight junctions of epithelial cells in vitro. In our study, we observed that the interaction between ASPP2 and Par-3 is impaired following silencing of FIH-1which leads to changes in the intracellular localisation of the protein complex in a cell type dependent manner. These findings demonstrate for the first time an impact of FIH-1-dependent hydroxylation on ARD-containing FIH-1 substrates. In contrast to HIF-α where hydroxylation of N803 prevents the association with transcriptional co-activators, the interaction of ASPP2 and Par-3 and the junctional localisation of both proteins was triggered by FIH-1-dependent hydroxylation. Depletion of FIH-1 as well as incubation with the hydroxylase inhibitor dimethyloxalylglycine (DMOG) in part disrupted the interaction and the interdependent junctional localisation of ASPP2 and Par-3. Although cancer cell adhesion and migration were not altered in vitro, FIH-1-dependent hydroxylation of ASPP2 may well affect the integrity of tight junctions and the barrier function of epithelia in vivo. Thus further in vivo studies are required to examine the physiologic effects of FIH-1-depletion. Furthermore, the role of the interaction between ASPP2 and Par-3 may be interesting to study in other cell types as to date all studies were performed in epithelial cells exclusively. Taken together, our results demonstrate that protein interactions of ARD-containing FIH-1 substrates can be modified by hydroxylation. This is likely to apply to other FIH-1 substrates indicating implications for FIH-1 in a broad range of cellular signalling pathways where ARD-containing proteins are involved.

Die posttranslationale Hydroxylierung durch Fe(II)- und 2-Oxoglutarat-abhängige Dioxygenasen wird zunehmend als bedeutsame Protein-Modifikation anerkannt. Es wurde z.B. gezeigt, dass FIH-1-abhängige Hydroxylierung von HIF-α Untereinheiten die Interaktion mit Co-Aktivatoren beeinflusst und dadurch die transkriptionelle Aktivität von HIF reguliert. Drüber hinaus wurde kürzliche eine neue Gruppe von FIH-1-Substraten entdeckt, die alle in einer hochkonservierten Protein Interaktionsdomäne, der Ankyrin Repeat Domäne (ARD), hydroxyliert werden. In dieser Arbeit wurde ein neues Substrat von FIH-1, Apoptose-stimulierendes p53-bindendes Protein 2 (ASPP2) identifiziert und charakterisiert. Es wurde gezeigt, dass N986 in der ARD von ASPP2 sowohl in vitro als auch in kultivierten Zelllinien durch FIH-1 hydroxyliert wird. Im Gegensatz dazu wurde ein hochkonserviertes Mitglied der gleichen Proteinfamilie, inhibitorisches ASPP (iASPP) in vitro nicht durch FIH-1 modifiziert. Dies belegt, dass, obwohl bereits einige ARD Proteine als Substrate identifiziert wurden und das Enzyme eine hohe Variabilität der Hydroxylierungsstelle toleriert, bestimmte Voraussetzungen für die Hydroxylierung durch FIH-1 gegeben sein müssen und die Reaktion mit einer gewissen Spezifität erfolgt. Die physiologischen Effekte der FIH-1-abhängigen Hydroxylierung von ASPP2 wurden in Krebs-Zelllinien, in denen die Expression des Enzyms durch lentivirale Transduktion von shRNA supprimiert wurde, untersucht. Obwohl ASPP2 als Regulator der p53-abhängigen Apoptose identifiziert wurde, hatte die Suppression von FIH-1 keinen Einfluss auf diesen Signalweg und auch die Interaktion zwischen ASPP2 und p53 wurde durch Silencing von FIH-1 nicht beeinflusst. Generell hatte endogenes ASPP2 keinen Einfluss auf die Stressantwort von p53-profizienten Zellen nach Behandlung mit verschiedenen Chemotherapeutika. Darüber hinaus waren auch Proliferation, Adhäsion und Migration nach Suppression von FIH-1 im Wesentlichen unverändert. Im Gegensatz dazu war die Interaktion zwischen ASPP2 und dem Tight Junction Protein partitioning defective 3 Homolog (Par-3), welche sowohl für die Regulation der Zellpolarität und der Proliferation neuronaler Vorläuferzellen in vivo als auch für die Ausbildung und Aufrechterhaltung von Tight Junctions in Epithelzellen in vitro von Bedeutung ist, durch Suppression von FIH-1 beeinträchtigt. In dieser Arbeit konnten wir nachweisen, dass die reduzierte Interaktion von ASPP2 und Par-3 nach Depletion von FIH-1 zu einer Umverteilung beider Proteine innerhalb der Zelle führt, wobei ASPP2 und Par-3 nicht länger vorwiegend an Zell-Zell-Kontakten lokalisiert sind. Somit konnten wir zum ersten Mal einen Nachweis für die Funktion der Hydroxylierung von ARD Proteinen erbringen. Wie im Falle von HIF beeinflusst FIH-1-abhängige Hydroxylierung die Assoziation von ASPP2 mit Interaktionspartnern. Im Gegensatz zu HIF-α Untereinheiten, deren Hydroxylierung durch FIH-1 die Interaktion mit transkriptionellen Co-Aktivatoren hemmt, fördert FIH-1-abhängige Hydroxylierung Zelltyp-spezifisch die Interaktion zwischen Par-3 und ASPP2. Der gleiche Effekt wurde auch durch den Hydroxylase-Inhibitor Dimethyloxalylglycin (DMOG) erzielt, was den Effekt eindeutig auf die Aktivität des Enzyms und somit die Modifikation zurückführt. Obwohl weder Adhäsion noch Migration der Zellen in vitro von der Suppression von FIH-1 beeinflusst waren, ist es möglich, dass beispielsweise die Integrität und Barriere-Funktion von Epithelien in vivo beeinträchtigt ist. Daher sind weiterführende in vivo Studien erforderlich, um den physiologischen Effekt der veränderten Lokalisation und Interaktion von ASPP2 und Par-3 aufzuklären. Außerdem wäre es interessant, die Interaktion von ASPP2 und Par-3, die bisher nur in Epithelzellen untersucht wurde, sowie den Einfluss von FIH-1 in anderen Zelltypen zu charakterisieren. Zusammenfassend konnten wir am Beispiel von ASPP2 zeigen, dass Proteininteraktionen von ARD-Proteinen durch FIH-1-abhängige Hydroxylierung reguliert werden können. Dies könnte nicht nur auf ASPP2 zutreffen, sondern auch auf andere ARD-Proteine. FIH-1-abhängige Hydroxylierung könnte somit eine Vielzahl zellulärer Signalwege, in denen ARD-Substrate involviert sind, durch Modulation von Proteininteraktionen regulieren.

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Janke, Kirsten: Characterisation of apoptosis-stimulating p53 binding protein 2 (ASPP2) as a new substrate for asparaginyl hydroxylation. 2013.

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