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Trehalose Metabolismus in (Hyper-) thermophilen Archaea

Hagemann, Anna

Die Rolle und Synthese von Trehalose sowie die Regulation der Trehalose-Synthese-Wege in Archaea ist bisher nicht völlig geklärt. In dieser Arbeit sollten der TPSP-Weg aus T. tenax, sowie der TreT/OrfY-Weg in den Crenarchaeota T. tenax, S. acidocaldarius und S. solfataricus untersucht werden, um eine mögliche Funktion von Trehalose als kompatibles Solut aufzuklären. Die T. tenax Trehalose-6-Phosphat Synthase/Phosphatase (TPSP) zeigt eine hohe Phosphatase-Aktivität, muss jedoch über die kotranskribierte Glykosyltransferase (GT) aktiviert werden um über die bifunktionale Synthase-Phosphatase-Aktivität zu verfügen. Dabei beruht die Aktivierung der TPS-Aktivität durch GT auf der Fusion der beiden Domänen (TPS und TPP) der TPSP. „Yeast two-Hybrid“-Experimente deuten auf eine Komplexbildung in vivo hin; somit könnte dieser Komplex je nach Bedarf gesteuert werden. Zusätzlich zu diesem einzigartigen Komplex wurden Hinweise auf einen mechanosensitiven Kanal gefunden, der sich wahrscheinlich auf Änderungen der Membranspannung hin öffnet und schließt. So konnte ein Modell für die Stressantwort in T. tenax erstellt werden. Unter Stresseinwirkung, wie der Erhöhung der Salzkonzentration im Medium, bilden TPSP und GT einen Komplex, was zur Synthese von Trehalose führt. Somit kann die Zelle vor Schäden durch die gesteigerte Osmolarität geschützt werden. Ändern sich die Umgebungsbedingungen, so ändert sich auch die Membranspannung der Zelle. In Folge dessen öffnet sich der mechanosensitive Kanal und hydrierte Solute, wie z.B. Trehalose können aus der Zelle ausgeschleust werden. Normalisiert sich die Membranspannung, so schließt sich der Kanal wieder. Der TreT/OrfY-Weg in T. tenax besteht aus der Trehalose Glykosyltranferrierenden Synthase (TreT) und einem offenen Leserahmen unbekannter Funktion (OrfY). Wie von Kouril et al. 2008 gezeigt wurde, ist die TTX_TreT unidirektional, kann also nur die Synthese von Trehalose katalysieren und diese nicht abbauen. Dabei ist die Aktivität der TreT unabhängig von OrfY. Auch in S. solfataricus und S. acidocaldarius wurden die Gene treT und orfY identifiziert; in S. acidocaldarius bilden sie ein Operon. Dies scheint einzigartig für Thermoproteales und Sulfolobales, sowie für einige Bakterien. Ein Schwerpunkt der Arbeit war die Untersuchung von OrfY. Die Kristallisierung des Proteins (Dr. J. Martin, Prof. Dr. A. Lupas, MPI Tübingen) zeigte, dass das Protein OrfY eine völlig neuartige Faltung besitzt. OrfY besteht aus zwei nahezu identischen Domänen, die in HHpred Vorhersagen als TetR-Transkriptionsregulator-ähnliche Helix-turn-Helix (HTH)-Domänen identifiziert wurden. Ähnliche, jedoch nicht duplizierte HTH-Domänen finden sich neben den OrfY Homologen aus Bakterien und Archaea ebenfalls in Amylasen, PEP bindenden Proteinen, die teilweise als PEP Synthasen oder Pyruvat-Phosphat-Dikinasen oder Antwort Regulatoren annotiert sind, wie auch in Proteinen unbekannter Funktion aus thermoacidophilen Organismen und proteinkodierenden Sequenzen aus Metagenomprojekten. Strukturvergleiche zeigten konservierte Reste (H49/157 und D67/171), die ein aktives Zentrum bilden könnten, welches durch die Aromaten F12/120 und W71/175 vermutlich stabilisiert wird. Dies deutet auf eine enzymatische Aktivität hin. Es konnte gezeigt werden, dass die Gegenwart von Trehalose oder Glukose die Oligomerisierung von OrfY beeinflussen. Des Weiteren wurde übereinstimmend mit der HTH-Domänenstruktur eine starke DNA-Bindung beobachtet. Die Ergebnisse deuten darauf hin, dass OrfY einerseits Zucker binden und eventuell auch enzymatisch umsetzen kann, zum anderen als Helix-turn-Helix-Domänen-Protein aber auch DNA binden könnte. In den beiden untersuchten Sulfolobus Spezies findet sich zusätzlich zum TreT/OrfY-Weg ein zweiter Weg zur Trehalose-Synthese, der TreY/TreZ-Weg (Lama, 1990; Maruta, 1996). Für beide Organismen wurden Deletiosnmutanten konstruiert (MW001∆orfY, MW001∆treT, MW001∆treY, MW001∆orfY∆treT, MW001∆orfY∆treY, MW001∆treT∆treY und MW001∆treY∆orfY∆treT, bzw. S. solfataricus PBL2025∆treT), deren Wachstum unter verschiedenen Stressoren (erhöhte Salzkonzentration ((250 mM KCl, bzw. 300 mM NaCl) initial oder ab der logarithmischen-Wachstumsphase zugegeben (in S. acidocaldarius), bzw. 200 mM – 700 mM NaCl, initial zugegeben (bei S. solfataricus) , so wie eine erhöhte Wachstumstemperatur von 83, bzw. 85°C) untersucht wurde. Durch diese Experimente konnte gezeigt werden, dass Trehalose für beide Organismen unter Salzstress (besonders NaCl) wichtig ist. Sowohl der TreT/OrfY- als auch der TreY/TreZ-Weg sind essentiell für eine Stressantwort; es scheint keinen weiteren Trehalose-Synthese-Weg in diesen Organismen zu geben. In dieser Studie konnte gezeigt werden, dass OrfY eine Rolle bei der Bildung von Trehalose spielt. Des Weiteren zeigte sich, dass sowohl Mutanten ohne orfY, als auch ohne treT einen veränderten Phänotyp gegenüber dem Wildtyp unter Stresseinwirkung ausweisen, was bedeutet, dass sowohl TreT als auch OrfY für einen funktionellen TreT/OrfY-Weg essentiell sind. Dabei könnte OrfY eine regulatorische Funktion haben, was zu den HHpred Vorhersagen des TTX_OrfYs passt. Die Versuche legen nahe, dass der TreT/OrfY-Weg wie auch der TreY/TreZ-Weg nicht konstitutiv genutzt wird, sondern beide Wege Wachstumsphasen abhängig sind. Um dies weiter zu untersuchen, müssen Rohextrakt-Analysen mit Zellen aus verschiedenen Wachstumsphasen durchgeführt werden. Die Trehalose-Synthese scheint also in den beiden Sulfolobus Spezies unter Stressbedingungen induziert zu werden und das Disaccharid als kompatibles Solut zu fungieren.

The role of trehalose and its synthesis as well as the regulation of the pathways for trehalose-synthesis are not fully understood. The aim of the presented work was the investigation of the TPSP-pathway in T. tenax and the TreT/OrfY-pathway in the Crenarchaeota T. tenax, S. acidocaldarius and S. solfataricus in order to find a possible function of trehalose as compatible solute. The T. tenax trehalose-6-phosphate synthase/phosphatase (TPSP) shows high phosphatase-activity, however, the enzyme must be activated by the cotranscribed glycosyltransferase (GT) to comprise the full bifunctional synthase-phosphatase-activity. Thereby the activation of the TPS-activity by GT is based on the fusion of both domains (TPS and TPP) of the TPSP. „Yeast two-Hybrid“-experiments point to a complexation in vivo; hence, this complex might be regulated depending on the demand. Additional to this unique complex, there are evidences for a mechanosensitive channel, probably reacting to changes of the membrane tension by opening and closing. This way a model for the stress response in T. tenax was constructed. Within a stress situation, like the increase of salinity in the medium, TPSP and GT build a complex, leading to the synthesis auf trehalose. According to this, the cell is protected against damages by high osmolarity. When the environmental conditions change also the membrane tension changes, followed by the opening of the mechanosensitive channel. This way, hydrated solutes, e.g. trehalose, can flush out of the cell. After normalizing the membrane tension, the channel closes again. The TreT/OrfY-pathway in T. tenax comprises a trehalose glycosyl transferring synthase (TreT) and an open reading frame of unknown function (OrfY). As shown by Kouril et al. 2008, the TTX_TreT is unidirectional, only catalyzing the synthesis of trehalose. Here, the activity of TreT is independent from OrfY. Also in S. solfataricus and S. acidocaldarius the genes treT und orfY were identified; in S. acidocaldarius they are located within an operon. This seems to be unique for the Thermoproteales and Sulfolobales, as well as for some Bacteria. A milestone of this work was the examination of OrfY. The crystallization of the protein (Dr. J. Martin, Prof. Dr. A. Lupas, MPI Tübingen) showed, that the protein OrfY comprises a totally new folding. OrfY consist of two almost identical domains that show, according to predictions from HHpred, Helix-turn-Helix (HTH)-like domains with similarities to TetR-transcriptional regulators. Similar but not duplicated HTH-domains are amongst OrfY homologues in Bacteria and Archaea. These are also found in amylases, PEP-binding proteins annotated on the one hand as PEP-synthases and on the other hand as pyruvate-phosphate-dikinases or response regulators. The motif can also be found in proteins of thermoacidophilic organisms with unknown function and protein-coding sequences from metagenomic projects. Structural comparisons show conserved residues (H49/157 and D67/171), maybe building the active site, that presumably is stabilized by the aromates F12/120 and W71/175. All these facts point to an enzymatic activity. It was demonstrated, that the presence of trehalose and glucose affects the oligomerization of OrfY. Corresponding to the HTH-domain structure, a strong DNA-binding could be observed. The results indicate, that on the one hand OrfY binds and maybe even enzymatically converts sugar and on the other hand that the Helix-turn-Helix-domain protein also might bind to DNA. In both examined Sulfolobus species a second way for trehalose synthesis despite the TreT/OrfY-pathway is found: the TreY/TreZ-pathway (Lama, 1990; Maruta, 1996). For both organisms deletion-mutants were constructed (MW001∆orfY, MW001∆treT, MW001∆treY, MW001∆orfY∆treT, MW001∆orfY∆treY, MW001∆treT∆treY und MW001∆treY∆orfY∆treT, respectively S. solfataricus PBL2025∆treT). The growth was monitored under different stressors (elevated salt concentration (S. acidocaldarius: 250 mM KCl or 300 mM NaCl, respectively added initial or in the logarithmical growth phase, respectively; S. solfataricus: 200 mM – 700 mM NaCl added initial), as well as an increased growth temperature of 83 or 85°C, respectively). The experiments showed that trehalose is very important for both organisms under salt stress (especially NaCl). The TreT/OrfY- as well as the TreY/TreZ-pathway are essential for the stress response. It seems that there is no other trehalose-synthesis-pathway in these organisms. This study showed that OrfY plays a role in the formation of trehalose. Additionally, it could be shown, that mutants lacking orfY or treT, respectively, show an altered phenotype under stress conditions compared to the wildtype, pointing to the conclusion that TreT and OrfY are essential for a functional TreT/OrfY-pathway. OrfY might have a regulatory function, fitting to the HHpred predictions. The results indicate that the TreT/OrfY-pathway and the TreY/TreZ-pathway are not used constitutively but are growth phase dependent. To get further information crude extract analysis with cells from different growth phases should be performed. The trehalose-synthesis seems to be induced in both Sulfolobus species under stress conditions and the disaccharide appears to function as compatible solute.

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Hagemann, Anna: Trehalose Metabolismus in (Hyper-) thermophilen Archaea. 2013.

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