Interaktionsanalyse der Transkriptionsfaktoren Gli3 und Trps1 in Chondrozyten

Schneider, Verena

Der Multi-Zinkfinger Transkriptionsfaktor Trps1 reguliert gemeinsam mit dem Indian Hedgehog/Gli3 Signalweg die Differenzierung und Proliferation von Chondrozyten. Da Trps1 in vitro und in vivo spezifisch mit der Volllängen-Aktivatorform des Transkriptionsfaktors Gli3 (Gli3A), aber nicht mit dessen C-terminal trunkierten Repressorform (Gli3R) in Chondrozyten interagiert, sollte im Zuge dieser Dissertation die Funktion der Gli3A/Trps1 Interaktion untersucht werden. Zunächst wurde durch Co–Immunopräzipitationen gezeigt, dass Trps1 an die Transaktivatordomäne im C-Terminus des Gli3 Aktivators bindet. Diese Interaktion hat auf zellulärer Ebene eine Beeinflussung der zellulären Lokalisation von Gli3A in Abhängigkeit von der zellulären Lokalisation von Trps1 zur Folge. Aufgrund dieser Ergebnisse wurde eine vergleichende Analyse der DNA-Bindung von Gli3 und Trps1 mit Hilfe der Chromatin-Immunopräzipitation (ChIP) gefolgt von “Next-Generation Sequencing“ (ChIP-Seq) durchgeführt. Zuerst erfolgte eine retrovirale Infektion chondrogener ATDC5-Zellen um die Expression von myc-getaggten Formen von Gli3A, Gli3R und Trps1 zu gewährleisten. Nach Etablierung der ChIP mit diesen Zellen wurde präzipitiertes Chromatin für “Next-Generation Sequencing“ verwendet. Aufgrund der Analyse potentieller Binderegionen in den einzelnen Datensätzen wurden neue putative DNA-Bindemotive von Gli3 und Trps1 ermittelt. Die kooperative Bindung von Gli3A und Trps1 an DNA-Bereiche wurde mit ChIP gefolgt von qPCR, sowie mit Luciferase-Experimenten untersucht. Es konnte unter anderem eine Bindung von Gli3A und Trps1 im Promotorbereich von Wnt5a, einem Mitglied der Familien der Wnt-Signalmoleküle und Regulator der Chondrozytendifferenzierung, bestimmt werden. Luciferase-Experimente zeigten eine Aktivierung der Promotoraktivität durch Coexpression von Trps1 in HEK-293T-Zellen. In chondrogenen ATDC5-Zellen hingegen wurde die Promotoraktivität jeweils durch die Coexpression von Gli3A und Trps1 verstärkt, Coexpression von beiden Faktoren führt hierbei zu einem additiven Effekt. Somit stellt Wnt5a das erste gemeinsame Zielgen der Transkriptionsfaktoren Gli3A und Trps1 in Chondrozyten dar. Der generelle Transkriptionsfaktor Gtf2i wurde durch die Datensatzanalyse als ein putatives Zielgen von Trps1 ermittelt. Mittels in situ Hybridisierung konnte erstmals die spezifische Expression von Gtf2i in embryonalen Knochenanlagen gezeigt werden.

The multi-zinc-finger transcription factor Trps1 is known to cooperate with Indian hedgehog (Ihh)/Gli3 signalling to regulate chondrocyte differentiation and proliferation. Co-immunoprecipitation experiments conducted both in vitro and in vivo have demonstrated that Trps1 specifically interacts with the full length activator form of Gli3 (Gli3A) whereas the C-terminal truncated Gli3 repressor (Gli3R) form does not interact with Trps1. In order to define the binding domain of Trps1 within Gli3A, co-immunoprecipitations with differently truncated Gli3A C-terminal deletion constructs have been carried out. They resulted in a specific binding of Trps1 to the transactivation domain in the C-terminus of Gli3A. On a cellular level, the direct interaction of Gli3A and Trps1 influences the subcellular localization of Gli3A depending on the cellular localisation of Trps1, as confirmed by localisation studies using fluorescence microscopy. In order to analyse the Gli3-Trps1 interaction on a genetic level, chromatin immunoprecipitations (ChIP) of Trps1- and Gli3-containing complexes were performed to identify genes transcriptionally targeted by Trps1 and Gli3 during endochondral ossification. Murine chondrogenic ATDC5 cells were infected with retroviruses carrying coding sequences for either myc-tagged fusions to Gli3A, Gli3R, the Trps1 protein or the myc-tag alone. Chromatin extracts from ATDC5 cells ectopically expressing the myc-tagged proteins were immunoprecipitated using an antibody against the myc tag. Isolated chromatin after ChIP was used for ChIP-Seq using library preparation and sequencing technology of Illumina. Sequence analysis of the putative binding regions displayed the occurrence of yet unknown Gli3- and Trps1 DNA-binding motifs. Binding of Gli3A and Trps1 in the promoter of Wnt5a, a factor, which coordinates chondrocyte proliferation, could be verified by Luciferase experiments. Thereby a chondrocyte-specific activation of the Wnt5a promoter by Gli3A and Trps1 led to an additive enhancement of the luciferase activity after cotransfection of both factors. Careful analysis of the ChIP-Seq data of Trps1 revealed the binding of Trps1 to a region associated with the transcription factor Gtf2i. The limb-specific expression of Gtf2i could be confirmed for the first time by in situ hybridisation in the developing limb.

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Schneider, Verena: Interaktionsanalyse der Transkriptionsfaktoren Gli3 und Trps1 in Chondrozyten. 2013.

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