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Funktion und Evolution des geprägten Gens C15orf2/ NPAP1

Neumann, Lisa C.

Die chromosomale Region 15q11q13 enthält ein Cluster geprägter Gene, die entweder nur vom paternalen oder nur vom maternalen Chromosom exprimiert werden. Der Funktionsverlust paternal exprimierter Gene führt zum Prader-Willi-Syndrom. Obwohl der Funktionsverlust der SNORD116-Gene für die meisten Symptome des PWS verantwortlich zu sein scheint, könnten auch andere paternal exprimierte Gene eine Rolle spielen. Eines der geprägten Gene in der Region ist C15orf2, das im fetalen Gehirn ausschließlich vom paternalen Allel exprimiert wird und dessen monoallelische Expression im Rahmen dieser Arbeit auch im adulten Gehirn nachgewiesen wurde. Im Promotorbereich von C15orf2 befindet sich ein großes CpG-Island, von dem vermutet wurde, dass es an der Regulation der genomischen Prägung und Genexpression von C15orf2 beteiligt sei. Wie hier jedoch gezeigt wurde, ist das CpG-Island im Gehirn überwiegend methyliert und spielt für die Regulation der Expression vermutlich keine große Rolle. C15orf2 codiert für ein 1156 AS großes Protein mit sechs Kernlokalisationssignalen. Eine Protein-BLAST-Analyse sowie eine Analyse mit dem Signaturerkennungsprogramm InterProScan wiesen auf Sequenzhomologie mit dem Membrannukleoporin POM121 hin. Um herauszufinden, ob das C15orf2-Protein an den Kernporen lokalisiert ist, wurde eine stabile Zelllinie generiert, die FLAG-markiertes C15orf2 induzierbar exprimiert. In Immunfluoreszenzstudien an dieser Zelllinie wurde C15orf2 in der Zellkernperipherie detektiert, wo es mit NPCs und der Kernlamina co-lokalisiert war. Sehr hohe ektopische Expression führte in einigen Zellen zu einem Phänotyp mit Invaginationen der Zellkernhülle, die auf eine Störung der Kernhüllenintegrität bei unphysiologisch hohen C15orf2-Konzentrationen hinwiesen. Mit drei-dimensionaler strukturierter Illuminationsmikroskopie wurde die Kernhülle lichtmikroskopisch noch besser aufgelöst und eine spezifische Lokalisation von C15orf2 auf der nukleären Seite der NPCs beobachtet. Die NPC-Assoziation wurde zusätzlich mit einer Kernhüllen-Fraktionierungs-Methode biochemisch bestätigt. Im Rahmen dieser Arbeit wurde zum ersten Mal gezeigt, dass C15orf2 Teil des NPCs oder der NPC-assoziierten molekularen Netzwerke ist. Auf diesen Erkenntnissen basierend wurde vom „HUGO Gene Nomenclature Commitee“ der neue Name „Nuclear pore associated protein 1“ (NPAP1) für C15orf2 festgelegt. Das C15orf2-Gen besitzt kein murines Ortholog, war aber während der Primatenevolution einer starken positiven Selektion unterlegen und könnte daher wichtige primatenspezifische Funktionen besitzen. Im evolutionsbiologischen Teil dieser Arbeit wurde gezeigt, dassC15orf2 erst während der Primatenevolution in die chromosomale Region 15q11q13 integriert ist. In anderen Säugetieren, aber nicht in Nagetieren, wurden dagegen C15orf2-homologe Sequenzen gefunden, die hier NPAP1L genannt werden. Die NPAP1L-Gene in Säugetieren teilen Syntänie mit zwei humanen Pseudogenen auf Chromosom 9. Eine phylogenetische Analyse offenbarte die Existenz einer Genfamilie, die von dem vertebratenspezifischen Membrannukleoporin-Gen POM121 abstammt. Anders als POM121 sind die anderen Mitglieder der Familie, NPAP1L, NPAP1 und UPF0607, intronlos oder besitzen kleine, sekundär gebildete Introns. Daher ist ihr gemeinsamer Vorfahre vermutlich durch Retrotransposition von POM121 während einer frühen Phase der Säugetierevolution entstanden. NPAP1L unterlief in einigen Säugetierlinien segmentalen Duplikationen und ist in Nagetieren sekundär verloren gegangen. In der Primatenlinie führten vermutlich zwei weitere Retrotranspositionsereignisse zu den Schwestergenen C15orf2 und UPF0607, während NPAP1L hier zu einem Pseudogen wurde. Diese Ergebnisse zeigen, dass C15orf2 von dem Nukleoporin-Gen POM121 abstammt und zu einer Familie von säuger- und primatenspezifischen Retrogenen gehört.

The chromosomal region 15q11q13 contains a cluster of imprinted genes expressed from the paternal or maternal chromosome only. The loss of function of paternally expressed genes leads to Prader-Willi syndrome. Although the loss of function of the SNORD116 snoRNA cluster seems to be responsible for most clinical signs, other paternally expressed genes may also contribute to Prader-Willi syndrome. One of the imprinted genes in the region is C15orf2, which is expressed from the paternal chromosome only in fetal brain. In the course of this study, the monoallelic expression of C15orf2 was also shown in adult brain. However, the associated promoter CpG island was found to be heavily methylated on both alleles in the brain and therefore is unlikely to mediate the monoallelic expression. C15orf2 encodes an 1156 amino acid protein with six nuclear localization signals. Bioinformatic analyses showed significant sequence similarity with the transmembrane nucleoporin POM121. To investigate whether the C15orf2 protein is localized at the nuclear pore complex (NPC), a cell line was generated that expresses FLAG-tagged C15orf2 upon induction with doxycycline. In this cell line, immunofluorescence studies revealed the localization of C15orf2 at the nuclear periphery, where it co-localized with NPCs and the nuclear lamina. To further refine the subnuclear localization of C15orf2, super resolution microscopy with the 3D-SIM technology was applied. This technique revealed that the protein specifically localizes at the nucleoplasmic side of nuclear pore complexes, roughly in one layer with the nuclear lamina. The NPC association of C15orf2 was confirmed biochemically by a nuclear envelope fractionation approach. In the course of this study it was shown for the first time that C15orf2 is part of the NPC or its associated molecular networks. Based on these results, C15orf2 was renamed to ”Nuclear pore-associated protein 1” (NPAP1). The C15orf2 gene does not have an orthologue in the mouse, but it appears to have undergone strong positive selection in the primate lineage. In the evolutionary part of this work, it was shown that C15orf2 integrated into the chromosomal region 15q11q13 during primate evolution. In other mammals, but not in rodents, C15orf2-homologous sequences were identified, which were named NPAP1L. This group of orthologous genes share synteny with two human pseudogenes on chromosome 9. A phylogenetic analysis revealed the existence of a gene family with the three members NPAP1L, C15orf2, and UPF0607 that originated from the vertebrate-specific nucleoporin gene POM121, most likely by retrotransposition. These results for the first time show the relationship of C15orf2 and POM121 and introduce a new family of primate- and mammal-specific POM121-related retrogenes.

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Neumann, Lisa C.: Funktion und Evolution des geprägten Gens C15orf2/ NPAP1. 2013.

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