Biologische und methodische Aspekte des komplexen RhoA-Signalnetzwerkes : Sein Einfluss auf die HGF-Reaktion von A549-Zellen und einen FRET-basierten RhoA-Aktivitäts-Biosensor

Schwarz, Vera

Die kleine GTPase RhoA ist ein regulatorisches Protein mit zahlreichen Funktionen in der Organisation des Aktin-Cytoskeletts: Induktion von Stressfasern, Stabilisierung von Aktin-Filamenten sowie die Regulation von Zell-Zell- und Zell-Matrix-Kontakten sind bekannte Beispiele. Die Ausübung derart diverser Funktionen muss wiederum selbst zeitlich und örtlich präzise koordiniert werden. Dies ist möglich, da RhoA im GTP-gebundenen Zustand aktiv, im GDP-gebundenen Zustand jedoch inaktiv ist: RhoA wird durch zahlreiche Proteine reguliert, die seinen Nukleotid-Bindungszustand direkt verändern oder dies verhindern. Weitere Regulationsmechanismen für RhoA umfassen diverse kovalente Modifikationen, die seine Bindungsaffinitäten ändern oder es sogar für die proteasomale Degradation markieren. In dieser Arbeit wurde die Rolle von RhoA in der HGF-induzierten Stimulation von A549-Zellen untersucht. Bewegungsanalysen von Lebendzellaufnahmen zeigten, dass sich weder die RNAi-vermittelte Depletion des RhoA-Inaktivators p190A, noch die von RhoA selbst deutlich auf die HGF-induzierte Bewegung der Zellen auswirken. Biochemische Analysen zeigten, dass RhoA selbst infolge der HGF-Stimulation so reguliert wird, dass die Menge aktiven RhoAs ansteigt, während gleichzeitig die Gesamt-Menge an RhoA sinkt. Die Beobachtung dieser gegensätzlichen Regulation bietet eine Grundlage für zukünftige Studien der bei der RhoA-Regulation wirkenden Kompensationsmechanismen. Eine andere Fragestellung dieser Arbeit war, inwiefern die intrazelluläre Regulation von RhoA mit modernen, fluoreszenz-basierten Methoden zur Beobachtung der RhoA-Aktivität interferiert. Dies wurde am Beispiel eines genetisch codierten, FRET-basierten RhoA-Aktivitäts-Biosensors untersucht. Analysen zahlreicher Varianten des Biosensors mittels stimulierter Akzeptor-Emission, FLIM- und TIRF-Mikroskopie zeigten, dass das Signal des Biosensors nicht wie ursprünglich publiziert hauptsächlich durch variierende FRET-Effizienz in der Zelle und auch nicht unmittelbar durch den Nukleotid-Beladungszustand des Biosensors bestimmt wird. Stattdessen beeinflusst die Bindung des Biosensors an die Zellmembran seine Fluoreszenz. Die Ergebnisse legen auch nahe, dass der RhoA-Biosensor entgegen der bisherigen Annahmen nicht in vollem Umfang für die zellulären Regulationsmechanismen zugänglich ist. Insgesamt können die Ergebnisse dieser Arbeit für die Konstruktion und Verwendung von Rho-GTPase-Biosensoren von Nutzen sein: Sie liefern für zukünftige Studien konkrete Anregungen, welche möglichen intrazellulären Einflüsse auf die gemessenen Daten bedacht und überprüft werden sollten.

The small GTPase RhoA is a regulatory protein with multiple functions concerning the organization of the cytoskeleton. These include induction of stress fibers, stabilization of actin filaments and regulation of cell-cell and cell-matrix contacts. With this diverse range of functions, RhoA itself needs to be precisely regulated in a spatio-temporal manner. This is achieved by the fact that RhoA is active when it is GTP-bound, while its GDP-bound form is inactive: There are a plethora of proteins either directly changing its nucleotide-bound state or preventing the change. Further regulatory mechanisms of RhoA include covalent modifications, which influence its affinity towards other proteins or the plasma membrane or even target it for proteasomal degradation. Within the framework of this thesis the role of RhoA as well as its regulation in the context of HGF-mediated A549 lung cancer cell motility was investigated. Analysis of movement in time-lapse phase contrast movies showed that neither RNAi-mediated depletion of the RhoA-inactivator p190A nor of RhoA itself markedly influenced the movement of the cells in response to HGF. Biochemical analyses revealed bidirectional regulation of RhoA protein amount and activity levels: While the total amount of RhoA decreased upon stimulation with HGF, RhoA activity increased. This finding of simultaneous, yet oppositional regulation might inspire further research on the detailed mechanism of this process. The second part of the study addressed the impact of intracellular RhoA regulation on the readout of fluorescent tools to studying RhoA activity. To this end, a genetically encoded, FRET-based RhoA activity biosensor was analyzed in the intracellular context. Stimulated emission, FLIM and TIRF microscopy experiments performed with various versions of the biosensor showed that its readout is not dependent on varying FRET efficiency as was originally published. Furthermore, the readout does not directly reflect the nucleotide binding state of the biosensor. Instead, binding of the biosensor to the plasma membrane influences its readout. Additional observations suggest that contrary to the prevalent assumption, the RhoA biosensor is less accessible to intracellular regulators than the endogenous RhoA protein. In summary, the findings presented here provide inspiration for the construction and application of Rho GTPase activity biosensors: Future approaches in this field can profit from this thesis by considering the possible influences of the cellular context on the biosensor and including appropriate control measurements.

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Schwarz, Vera: Biologische und methodische Aspekte des komplexen RhoA-Signalnetzwerkes. Sein Einfluss auf die HGF-Reaktion von A549-Zellen und einen FRET-basierten RhoA-Aktivitäts-Biosensor. 2013.

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