Identifizierung neuer Biomarker für das Ovarialkarzinom – : Primärtumorbasierte Analysen und blutbasierte „Real-Time-Liquid-Biopsy“

Kuhlmann, Jan Dominik

Trotz Fortschritten in der Behandlung erleiden mehr als 50% der Patientinnen mit Ovarialkarzinom ein Rezidiv, wobei 15 % der Fälle platinresistent sind, was meist jedoch nur retrospektiv erkannt wird. In diesem Zusammenhang war Ziel dieser Dissertation, neue primärtumor- sowie blutbasierte Biomarkerkonzepte im Hinblick auf Platinresistenz und Prognose zu etablieren. Dies wurde zunächst im Rahmen einer primärtumorbasierten LOH-Analyse an vier tumorbiologisch relevanten chromosomalen Regionen realisiert. In diesem Zusammenhang erwies sich LOH proximal zum M6P/IGF2R-Lokus als neuer Biomarkerkandidat für die Tumorzelldisseminierung in das KM. Da Tumorgewebe jedoch nur einmal zum Zeitpunkt der Primärdiagnose zur Verfügung steht und sich nicht für ein Therapiemonitoring eignet, wurden nachfolgend experimentelle Strategien zur Biomarkeridentifikation auf ein blutbasiertes System transferiert. In diesem Sinne wurde die Methodik der primärtumorbasierten LOH-Detektion auf zirDNA im Blutserum der Patientinnen übertragen. Im Rahmen einer zusätzlichen Fraktionierung der zirDNA in HMF bzw. NMF, konnte die Sensitivität der LOH-Detektion deutlich verbessert werden. Des Weiteren zeigte sich nach Chemotherapie eine signifikante Reduktion des zirDNA Gehaltes in der NMF, jedoch nicht in der HMF. Diese Befunde implizierten, dass tumorassoziierte DNA in der Zirkulation vermutlich niedermolekularen Charakter aufweist. Somit könnte die Fraktionierungsmethodik eine selektive Untersuchung tumorassoziierter DNA im Blut erlauben. Ferner wurde LOH am PTEN-Lokus bzw. proximal zum M6P/IGF2R-Lokus als neuer blutbasierte Biomarker für die Tumorzelldisseminierung in das KM sowie für ein verkürztes OS beschrieben. Ergänzend wurde das Profil zirkulierender miRNA im Serum von Ovarialkarzinompatientinnen analysiert. In diesem Zusammenhang konnte miR-1246 im Vergleich zu Normalspenderinnen als signifikant hochreguliert identifiziert werden. Interessanterweise wurde während der experimentellen Phase dieser Dissertation durch eine Kooperationsgruppe gezeigt, dass der miR-1246 Detektionsassay eine starke Kreuzreaktivität mit RNU2-1f im Serum aufweist. Somit war das beobachtete miR-1246 Signal mit großer Wahrscheinlichkeit auf RNU2-1f und nicht auf miR-1246 zurückzuführen. Im Weiteren konnte ein signifikanter Zusammenhang zwischen der RNU2-1f Expression im Serum und dem FIGO-Stadium bzw. dem verbleibenden Tumorrest nach Operation beschrieben werden. Ferner identifizierte eine persistierende bzw. neu erworbene RNU2-1f Positivität nach Chemotherapie eine Patientinnengruppe mit tendenziell verkürztem OS. Dies ist die erste Beschreibung einer nicht kodierenden RNA, die als blutbasierter Biomarker für das Ovarialkarzinom fungieren könnte. Abschließend wurde auf die immunomagnetische Isolation bzw. molekulare Charakterisierung intakter ZTZ aus dem Blut fokussiert. Es konnte bereits gezeigt werden, dass die Präsenz von ZTZ im Blut vor Operation bzw. nach Chemotherapie mit einem verkürzten OS korrelierte. Weiterführend sollte die Hypothese überprüft werden, inwieweit der beobachtete prognostisch-negative Einfluss der ZTZ im Blut auf einen platinresistenzassoziierten Phänotyp dieser Zellen zurückzuführen sein mag. Daher wurde die Expression der DNA-Reparatur Endonuklease ERCC1, die bereits mit Platinsensitivität ovarieller Tumoren in Verbindung gebracht werden konnte, in ZTZ untersucht. ERCC1-Positivität wurde mit einer Inzidenz von 36 % vor Operation und 35% nach Chemotherapie beobachtet, interessanterweise auch in 30% der Patientinnen, die gemäß AdnaTest OvarianCancer, als ZTZ-negativ galten. Ein statistischer Zusammenhang zwischen der ERCC1-Expression und klinisch definierter Platinsensitivität ergab sich nicht, jedoch zeigte sich bei Patientinnen mit persistierend ERCC1-positiven ZTZ ein signifikant verkürztes DFS bzw. OS. Diese Befunde sprechen für eine Implementierung von ERCC1 in die ZTZ-Analyse und beschreiben ERCC1 als möglichen klinisch relevanten Biomarker, der Patientinnen mit besonders schlechter Prognose identifizieren könnte bzw. die Notwendigkeit einer Therapieänderung voraussagen mag. Des Weiteren konnte gezeigt werden, dass ZTZ von Ovarialkarzinompatientinnen zu etwa 14% EMT- bzw. stammzellassoziierte Marker exprimieren. Dies wurde auch bei Patientinnen beobachtet, die gemäß AdnaTest OvarianCancer ZTZ-negativ galten, was für die Heterogenität der ZTZ im Blut spricht. Die Detektion sowie das zielgerichtete Vorgehen gegen stammzellähnliche ZTZ könnte von großer klinischer Relevanz sein, da diese ZTZ-Subgruppe bereits mit Therapieversagen und Rezidiventwicklung in Verbindung gebracht wurde. Zusammenfassend konnte die vorliegende Dissertation einen relevanten Beitrag zur Etablierung neuer primärtumorbasierter Biomarkerkonzepte für das Ovarialkarzinom liefern und die Hypothese unterstützen, dass Patientinnenblut im Sinne einer „Real-Time-Liquid-Biopsy“ genutzt werden könnte.

Despite advances in treatment, more than 50% of patients with epithelial ovarian cancer will experience recurrence. Moreover, resistance to platinum based chemotherapy occurs in about 20% of cases and can only be assessed retrospectively during post-chemotherapy follow-up. In this regard, intention of this PhD thesis was to identify novel biomarkers, predicting therapy response and prognosis. This was initially realized by a primary tumor based LOH-analysis at four ovarian cancer relevant chromosomal regions. In this context, allelic loss proximal to the M6P/IGF2R locus was revealed as a novel biomarker candidate, predicting tumor cell dissemination into the bone marrow (BM). Given that primary tumor tissue is available uniquely by resection and does not allow therapy monitoring, experimental strategies for biomarker identification were subsequently transferred to a blood based context. In this regard, methods for primary tumor based LOH-detection were transferred to circulating DNA (cirDNA) in the blood serum of ovarian cancer patients. Fractionation of cirDNA into high- and low molecular weight fraction (HMWF, LMWF) broadly improved sensitivity of LOH-detection in the blood and cirDNA content in the LMWF but not in the HMWF significantly decreased after chemotherapy. These data implied that tumor-associated cirDNA in the circulation might primarily be of low molecular weight character and that cirDNA fractionation technique could allow selective analysis of tumor related DNA in the blood. Moreover, LOH at the PTEN-locus and proximal to M6P/IGF2R were suggested as novel blood based biomarkers for tumor cell dissemination into the BM and a reduced overall survival (OS). In addition to this approach, the profile of circulating microRNA in the blood of ovarian cancer patients was analyzed. In this context, miR-1246 was found to be significantly overexpressed in the blood of cancer patients compared to healthy donors. Interestingly, during the experimental stage of the experiments, a cooperation group showed that the miR-1246 detection assay was highly cross-reactive with U2 small nuclear RNA fragments (RNU2-1f). Consequently, the observed miR-1246 signal in the circulation was likely derived from RNU2-1f than from miR-1246. Circulating RNU2-1f levels at primary diagnosis paralleled the tumor stage, whereas RNU2-1f expression after chemotherapy correlated with residual tumor burden left after surgery. Moreover, persisting or newly acquired RNU2-1f positivity after chemotherapy trended to identify a patient group with reduced OS. This is the first report, suggesting a small non coding RNA as blood-based biomarker for ovarian cancer patients. Finally, experimental strategies focused on the immunomagnetic isolation and molecular characterisation of circulating tumor cells (CTC) in the blood. In this regard, the presence of CTC before surgery and after chemotherapy was previously ascertained to predict a reduced overall survival. Continuatively, it should be investigated, whether negative prognostic impact of CTC may arise from a cellular phenotype being associated with platinum resistance. In this regard, we assessed expression of Excision repair cross-complementing rodent repair deficiency, complementation group 1 (ERCC1) in CTC, which takes part in the DNA nucleotide excision repair pathway and has already been described as a primary tumor-based biomarker for platinum resistance in ovarian cancer. ERCC1-positivty rate was 36% before surgery and 35% after chemotherapy. Interestingly, 30% of patients with positive CTC-status, according to AdnaTest OvarianCancer, were positive for ERCC1-expression. No association between clinically defined platinum resistance and ERCC1-positivity was observed. However, patients with persistently positive ERCC1-expression in paired blood samples before surgery and after chemotherapy had a significantly decreased OS and DFS. Thus, implementing ERCC1 expression in CTC analysis of patients may identify a subgroup of ovarian cancer patients with worse prognosis. Apart from this, ERCC1 might serve as a valuable biomarker for monitoring disease to possibly change treatment in case of ERCC1-persistent CTC. Moreover, the expression of EMT- and stem cell associated transcripts was demonstrated in 14% of ovarian cancer patients. This was also observed in case of CTC-negative patients, suggesting the heterogeneity of CTC in the blood. Given that stem cell like CTC may be associated with therapy failure and recurrence of ovarian carcinomas, detecting and targeting of these cells could be of prior interest for the clinic. Conclusively, this PhD-thesis contributed to the identification of novel primary tumor based biomarker concepts for ovarian cancer and corroborates the hypothesis that the patient’s blood could be utilized in terms of a “Real-Time-Liquid-Biospy”.

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Kuhlmann, Jan Dominik: Identifizierung neuer Biomarker für das Ovarialkarzinom –. Primärtumorbasierte Analysen und blutbasierte „Real-Time-Liquid-Biopsy“. 2013.

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