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Charakterisierung eines modularen und proteinbasierten Kontrastmittels für die Magnetresonanztomographie

Grum, Daniel

Die vorliegende Promotionsarbeit befasst sich mit der biochemischen und biophysikalischen Charakterisierung des Proteins Zarvin, welches als erster Ansatz zur Entwicklung eines variablen (modularen) Gadolinium(III)-basierten "T" _"1" -Kontrastmittels zur Detektion von Metastasen mit Hilfe der Magnetresonanztomographie dienen soll. Ein in der Literatur bisher wenig untersuchter Ansatz der direkten Kopplung des Gadolinium(III) an ein Protein sollte dabei weiter evaluiert werden, da dieser Ansatz eine hohe Effizienz des Kontrastmittels bei verhältnismäßig niedrigem Molekulargewicht erlauben würde. Zarvin wurde am Institut für Bioinformatik der Universität Duisburg-Essen entwickelt und besteht zur Erfüllung dieser Aufgaben aus zwei Domänen, die durch einen flexiblen, aus zehn Glycinen bestehenden, Linker voneinander getrennt sind. Die sich N terminal befindende Domäne ist eine Mutante der sog. B Domäne des Proteins A aus dem Organismus Staphylococcus aureus und wird in der Literatur als Z Domäne bezeichnet. Letztere besitzt die Eigenschaft, selektiv an den "F" _"c" -Bereich humaner (z. T. auch anderer Säugetiere) Antikörper zu binden. Diese Eigenschaft sollte hier dazu genutzt werden, dem Kontrastmittel in Kombination mit kommerziell verfügbaren therapeutischen Antikörpern eine schnell variierbare Zielführung zu unterschiedlichen Zielstrukturen zu ermöglichen. Als C-terminale Domäne des Zarvins wurde zunächst eine hoch affin Ca2+-bindende Mutante eines Parvalbumin-Proteins aus der Ratte, das S55D/E59D α Parvalbumin, gewählt. Diese Domäne sollte dazu genutzt werden, zwei Gadolinium(III)-Ionen zu binden, welche dem Protein die benötigten Kontrast gebenden Eigenschaften eines "T" _"1" -Kontrastmittels verleihen. Für die Charakterisierung von Zarvin wurden dessen Nukleotidsequenz sowie die Nukleotidsequenz der einzelnen Domänen mittels rekombinanter DNA-Technologie in einen Expressionsvektor kloniert und die entsprechend translatierten Proteine gereinigt. Mit Hilfe von CD- sowie 2D-NMR-Spektroskopie konnte eine korrekte Faltung beider Domänen innerhalb des Proteins Zarvin bestätigt werden. Die Funktionalität der Z-Domäne wurde weiterhin mittels Fluoreszenzmarkierung von Zarvin bzw. analog produzierter Cystein-Mutanten untersucht. Es konnte nachgewiesen werden, dass das Protein in vitro mit ähnlicher Affinität wie die separate Z Domäne an einen IgG-Antikörper bindet sowie in Kombination mit letzerem in der Lage ist, an Zellen mit entsprechenden Zielstrukturen in der Zellmembran zu binden. Die Funktionalität der Parvalbumin-Domäne in Bezug auf die Bindung von Lanthanoiden wie Gadolinium(III) wurde mit Hilfe der Etablierung eines Terbium(III)-Lumineszenz-Systems untersucht. Es konnte nachgewiesen werden, dass Zarvin Lanthanoide wie Tb3+ und Gd3+ mit subpicomolarer Affinität bindet. Die mittels CD-Spektroskopie untersuchte thermische Stabilität der Faltung dieser Holoform des Proteins erwies sich als sehr hoch. Ebenso war das Protein zumindest in vitro in fötalem Kälberserum nicht suszeptibel gegenüber proteolytischem Abbau. Beide Eigenschaften zeichnen das Protein als gutes Gerüst für die Entwicklung eines proteinbasierten Kontrastmittels aus. Zu lösende Problematiken, die in Verbindung mit Zarvin herausgestellt wurden, sind die unter simulierten in vivo Bedingungen sehr niedrigen kinetischen Stabilitäten der Interaktion zwischen der Parvalbumin-Domäne und Lanthanoiden sowie zwischen der Z-Domäne und einem Antikörper. Die Charakterisierung der relaxometrischen Eigenschaften des Zarvin:(Gd3+)2 zeigte, dass eine entsprechende Optimierung dieser kinetischen Eigenschaften lohnend wäre. Die in Form der "T" _"1" -Relaxivität "r" _"1" quantifizierte Effizienz des Zarvin:(Gd3+)2 als "T" _"1" Kontrastmittel erwies sich im Bereich von Feldstärken um 1,5 Tesla und auch noch bei 3 Tesla als sehr hoch. Das in vitro bei diesen Feldstärken geschätzte Detektionslimit liegt im niedrigen mikromolaren Bereich und befindet sich damit in der Größenordnung hoch exprimierter Zielstrukturen auf Tumorzellen. Die in dieser Arbeit experimentell erhaltenen und diskutierten Ergebnisse bilden daher eine Grundlage für Ansätze zur Entwicklung eines verbesserten proteinbasierten "T" _"1" -Kontrastmittels.

The present thesis deals with the biochemical and biophysical characterisation of the protein Zarvin, which was designed as a first approach for the development of a variable (modular) Gadolinium(III)-based "T" _"1" contrast agent capable of detecting metastases employing Magnetic Resonance Imaging. For that, a so far hardly investigated approach of directly coupling the Gadolinium(III) to a protein should be further evaluated, because in this way a highly efficient contrast agent based on a relatively low molecular weight could be developed. Zarvin was designed at the Department of Bioinformatics at the University of Duisburg-Essen. To fulfil both of its tasks, modularity as well as contrast producing properties, Zarvin consists of two domains separated by a flexible decaglycine linker. The N terminal domain is a mutant of the so called B-domain of protein A from Staphylococcus aureus and is designated as Z domain in literature. The latter domain of Zarvin is able to bind selectively to the constant region ("F" _"c" ) of human (in part also of other mammals) IgG antibodies. This property was intended to be used in combination with commercially available therapeutic antibodies to allow for a quick and variable targeting of the contrast agent to different physiological target structures. For the C terminal domain of Zarvin the highly affine Ca2+-binding S55D/E59D rat α Parvalbumin mutant was chosen in a first step. This domain was intended to be used for binding of two Gadolinium(III) ions and thus for providing the necessary contrast producing properties of a "T" _"1" contrast agent. In order to be able to characterise Zarvin, the nucleotide sequences of Zarvin as well as of the single domains were cloned into an expression vector. After purification of the expressed proteins, the proper folding of both domains within the two-domain protein Zarvin was confirmed employing CD and 2D-NMR spectroscopy. Further, the functionality of the Z domain was investigated using fluorescently labelled cystein mutants of Zarvin. It could be shown that Zarvin in vitro binds to an IgG antibody with an affinity similar to the separate Z domain and that in combination with this antibody Zarvin is able to target cells expressing the respective target structures in the cell membrane. The functionality of the Parvalbumin-domain concerning the binding of lanthanides like Gadolinium(III) was investigated by establishing a Terbium(III) luminescence system. It could be shown that Zarvin binds lanthanides like Tb3+ and Gd3+ with subpicomolar affinity. The thermal stability of this holoform of the protein was investigated using CD spectroscopy and proved to be very high. Further, the protein was in vitro not susceptible towards proteolytic degradation in fetal calf serum. Both properties characterise Zarvin as a good scaffold for the development of a protein-based contrast agent. Remaining problems to be solved, which were pointed out in combination with Zarvin by simulating in vivo conditions, are the low kinetic stabilities of the interaction between the Parvalbumin-domain and lanthanides as well as between the Z domain and an antibody. The relaxometric characterisation of the Zarvin:(Gd3+)2 complex however showed that an optimisation of the respective kinetic properties would be worthwhile. The quantified efficiency of Zarvin:(Gd3+)2 in terms of the "T" _"1" relaxivity "r" _"1" proved to be very high at field strengths around 1,5 Tesla and also as clearly higher than "r" _"1" values of small molecular weight contrast agents at 3 Tesla. Concerning the detection limit of the contrast agent at these field strengths, low micromolar concentrations were estimated, which are in the range of concentrations of highly expressed target structures in the cell membrane of tumour cells. The experimentally obtained and discussed results of this thesis therefore provide a basis for further approaches to develop an improved protein-based "T" _"1" contrast agent.

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Grum, Daniel: Charakterisierung eines modularen und proteinbasierten Kontrastmittels für die Magnetresonanztomographie. 2013.

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