Mechanistic investigation on methylation of metal(loid)s by methylcobalamin

Würfel, Oliver

The methylation of metal(loid)s is a widespread phenomenon in the environment which occurs by abiotic as well as enzymatically catalyzed transfer of a methyl group. While S-adenosyl methionine is the main methyl-donor in many bacteria and mammals, methylcobalamin (CH3Cob) can be the methyl-donor for the methylation of metal(loid)s by anaerobic microorganisms, such as methanoarchaea. Several reaction mechanisms have been proposed for the enzyme-catalyzed as well as the abiotic methylation, but have not really been proven yet. Since the methylation alters both biomobility and toxicity of the precursory metal(loid)s, the full comprehension of the underlying reaction mechanisms is of high importance for a conclusive risk assessment. Hence, in this thesis new approaches and techniques were developed, validated, and applied to foster the understanding of the methylation of the group 15 and 16 metal(loid)s arsenic, selenium, antimony, tellurium, and bismuth by CH3Cob. Here, particular emphasis was put on the toxicologically highly relevant element arsenic, which is a widespread contaminant in drinking water.
In terms of methylation of metal(loid)s by methanoarchaea, the role cob(I)alamin (Cob(I)) regarding this process was reinvestigated, since a catalytic role of the former was suggested for the methylation of metal(loid)s by CH3Cob in the literature – Cob(I) is intermediary formed by enzyme-catalyzed (MtaA) transfer of the methyl group from CH3Cob to coenzyme M (CoM) in the course of methylotrophic methanogenesis. UV/Vis spectroscopic and purge and trap (P&T) gas chromatography (GC) inductively coupled plasma mass spectrometry (ICP-MS) analyses revealed that Cob(I) induces the transfer of the methyl group from CH3Cob to the metal(loid)s. Since this indicates that biological electron carriers are important factors for the methylation capability of methanoarchaea, the efficiency of abiotic methylation of As, Bi, Sb, Se, and Te by CH3Cob was studied in the presence of glutathione (GSH) as cofactor in many bacteria and eucaryotes. In comparison, the methylation by CH3Cob in presence of CoM and by titanium citrate that is often used in biochemical assays as well as photolytic induced methylation was investigated exemplarily for arsenic. As all of the investigated biological “reducing agents” induced the methylation of metal(loid)s, different biological reducing agents apparently might contribute to the multi-element methylation in vivo in dependency of their availability.
For a more detailed mechanistic investigation of the MtaA-mediated methylation of arsenic, a new oxidation-state specific hydride generation technique was developed, which is also an alternative to common high performance liquid chromatography for analysis of environmental samples. Here, the efficient methylation of trivalent arsenic species without a change in oxidation state indicated, that the methyl transfer does proceed via a non-oxidative methylation. In addition, thorough UV/Vis and P&T-GC-ICP-MS analyses pointed towards a similar mechanism for antimony, bismuth, selenium, and tellurium and indicated that the methyl group transfer proceeds either via a concerted nucleophilic substitution or via a caged radical mechanism. Another approach to investigate the biomethylation and elucidate the proposed reaction mechanisms, is the investigation of the carbon isotopic fractionation due to the transfer of the methyl group to the metal(loid). For example, the extent of the kinetic isotope effect (KIE) allows the differentiation between different reaction types, such as concerted (SN2) or stepwise (SN1) nucleophilic substitution. Hence, the first method for determination of the carbon isotopic composition of metal(loid) compounds in complex matrices was developed. It involves selective hydride generation of the organometal(loid)s followed by P&T enrichment, heart-cut gaschromatography and isotope ratio mass spectrometry (IRMS). The applicability was demonstrated for biogenically formed trimethylarsine oxide in a compost sample. Afterwards, the method was extended and optimized to the analysis of partly methylated arsenicals.
For an investigation of the occurring KIE due to the methyl transfer, a prerequisite is the determination of initial δ13C of the transferred methyl group. Because of the high importance of this δ13C-value, different independent approaches for methyl group abstraction were applied, including reaction with platinum (II/IV) couples or HI, light irradiation as well as thermolytic cleavage. Subsequently, the products were analyzed by GC-IRMS or by flow injection analysis (FIA)-IRMS in the case of Pt. By use of the developed IRMS techniques, the KIE of the abiotic GSH-induced methylation of arsenic by CH3Cob was determined and pointed to a concerted reaction mechanism.
Overall, the results of this thesis advance the field of biomethylation and the developed techniques offer new opportunities to investigate methylation of metal(loid)s in the environment.

Die Methylierung von Metall(oid)en ist in der Umwelt ein weit verbreitetes Phänomen und erfolgt durch den abiotischen als auch enzymkatalysierten Transfer einer Methylgruppe. Während in vielen Bakterien und Säugetieren S-Adenosylmethionin (SAM) die Hauptquelle für diese Methylgruppen darstellt, kann bei anaeroben Mikroorganismen, wie den Methanoarchaeen, Methylcobalamin (CH3Cob) als Methyldonor dienen. Verschiedene Reaktionsmechanismen wurden bereits postuliert, jedoch noch nicht schlüssig bewiesen. Da die Methylierung sowohl die Bioverfügbarkeit als auch die Toxizität der anorganischen Ausgangsstoffe stark verändert, ist ein komplettes Verständnis der zu Grunde liegenden Mechanismen von hoher Wichtigkeit für eine schlüssige Risikoabschätzung. Daher wurden neue Ansätze und Analysetechniken entwickelt, validiert und verwendet, um ein besseres Verständnis des Methylierungsprozesses von As, Sb, Te, Se und Bi durch CH3Cob zu ermöglichen. Besonders Augenmerk lag dabei auf dem toxikologisch hoch relevanten As, welches ein weit verbreiteter Umweltschadstoff im Trinkwasser ist.
Bezüglich der Methylierung von Metall(oid)en durch Methanoarchaen, wurde die Rolle von Cob(I)alamin (Cob(I)) in diesem Prozess genauer untersucht, da in der Literatur dessen katalytische Rolle in Betracht gezogen wurde – Cob(I) wird intermediär durch den MtaA-katalysierten Transfer der Methylgruppe von CH3Cob zu Coenzym M (CoM) im Laufe der methylotrophen Methanogenese gebildet. Untersuchungen mittels UV/Vis-Spektroskopie sowie Gaschromatographie (GC) nach Purge&Trap (P&T) in Verbindung mit induktiv gekoppeltem Plasma Massenspektrometrie (ICP-MS) führten zu der Erkenntnis, dass Cob(I) den Transfer der Methylgruppe von CH3Cob zu den Metall(oid)en induziert. Da dies belegt, dass biologische Elektronenüberträger bedeutende Faktoren für die Befähigung zur Methylierung der Methanoarchaeen sind, wurde die Effizienz der abiotischen Methylierung von As, Sb, Se,Te und Bi durch CH3Cob in Gegenwart von Glutathion (GSH) als wichtigem Kofaktor in vielen Bakterien und Eucaryoten untersucht. Zum Vergleich wurde die Methylierung in Gegengenwart von CoM oder Titancitrat, das oft in biochemischen Assays eingesetzt wird, sowie die Photomethylierung exemplarisch an As untersucht. Da alle untersuchten „Bioreduktionsmittel“ den Transfer der Methylgruppe von CH3Cob zu As induzieren konnten, legt dies nahe, dass verschiedene Bioreduktionsmittel in Abhängigkeit von ihrer Verfügbarkeit zur Methylierung in vivo beitragen können. Zur detaillierteren Untersuchung des Reaktionsmechanismus der MtaA-vermittelten Methylierung von As durch CH3Cob wurde eine neue Oxidationsstufenspezifische Hydridgenerierung (HG) in Verbindung mit Analyse via GC-ICP-MS entwickelt. Die effiziente Methylierung nur der dreiwertigen Arsenspezies ohne Änderung der Oxidationsstufe deutete darauf hin, dass der Transfer der Methylgruppe über eine nicht-oxidative Methylierung erfolgt. Des Weiteren zeigten detaillierte UV/Vis und P&T-GC-ICP-MS Analysen, dass es sich wahrscheinlich um einen ähnlichen Mechanismus für Se, Sb, Te und Bi handelt und dass der Methyltransfer mittels einer konzertieren nukleophilen Substitution oder in einem „caged“ Radikalmechanismus erfolgen muss.
Ein anderer Ansatz zur Untersuchung der Biomethylierung und Aufklärung der Reaktionsmechanismen ist die Analyse der Kohlenstoff-Isotopenfraktionierung während des Transfers der Methylgruppe zum Metall(oid). Anhand der Größe des auftretenden kinetischen Isotopeneffektes (KIE) lassen sich beispielsweise eine konzertierte und eine schrittweise nukleophile Substitution voneinander unterscheiden. Daher wurde die erste Methode entwickelt, um das Kohlenstoffisotopenverhältnis von metall(loid)organischen Verbindungen in einer komplexen Matrix bestimmen zu können. Die Methode nutzt die selektive HG der Organometall(oid)e zur Volatilisierung und Matrixabtrennung gefolgt von P&T-Anreicherung, Heart-Cut Gaschromatographie und Isotopenverhältnis-Massenspektrometrie (IRMS). Die Anwendbarkeit der Methode wurde anhand der Analyse eines mit Trimehylarsenoxid belasteten Kompostes gezeigt. In einem weiteren Schritt wurde die Methode für die Analyse der niedrig siedenden teilmethylierten Arsenverbindungen erweitertet und optimiert.
Um letztendlich den KIE untersuchen zu können, muss der Startwert, das Isotopenverhältnis der zu transferierenden Methylgruppe, bestimmt werden. Aufgrund der hohen Bedeutung des Isotopenwertes wurden mehrere voneinander unabhängige Verfahren für die positions-spezifische Isotopenanalyse von CH3Cob angewendet – Abstraktion der Methylgruppe mittels HI, Licht, erhöhter Temperatur sowie Pt (II/IV) und anschließende Analyse der Reaktionsprodukte mittels GC IRMS oder Fließinjektionsanalyse (FIA)-IRMS im Falle von Pt. Mittels der entwickelten IRMS Techniken wurde schließlich die abiotische Methylierung von Arsenit in Gegenwart von GSH durch CH3Cob untersucht. Der ermittelte KIE deutet dabei auf eine konzertierte Reaktion hin.
Insgesamt liefert diese Doktorarbeit neue Erkenntnisse auf dem Gebiet der Biomethylierung und darüber hinaus bieten die entwickelten Techniken neue Möglichkeiten die Methylierung von Metall(oid)en in der Umwelt zu untersuchen.

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Würfel, Oliver: Mechanistic investigation on methylation of metal(loid)s by methylcobalamin. 2013.

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