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Funktionelle Analyse von Numb und Redefinition der humanen hämatopoetischen Hierarchie

Görgens, André

Hämatopoetische Stammzellen (HSZ) müssen in der Lage sein, die tägliche Produktion von Milliarden von spezialisierten Blutzellen aufrecht zu erhalten. Sie stellen die bislang am besten untersuchten somatischen Stammzellen dar, aber die Mechanismen, die ihre Entwicklung und ihre Differenzierung regulieren, sind weitgehend unklar. Vordaten aus unser Arbeitsgruppe deuten darauf hin, dass Numb, eine aus Drosophila als Antagonist des Notch-Signalweges bekannte Zellschicksalsdeterminante, auch an der Zellschicksalsspezifikation humaner hämatopoetischer Stamm- und Vorläuferzellen (HSVZ) beteiligt ist.
Da der Notch-Signalweg ein wichtiger Faktor beim Selbsterhalt von HSZ in Säugern ist, war das primäre Ziel dieser Arbeit, die Funktion von Numb in humanen HSVZ (CD34+ Zellen) näher zu untersuchen und die Frage zu klären, ob Numb in der humanen Hämatopoese, ebenso wie in Drosophila, als Notch-Antagonist fungiert. In Übereinstimmung mit Vordaten aus unserer Gruppe konnte gezeigt werden, dass die Überexpression von Numb die Aufrechterhaltung primitiver Zellschicksale unterdrückt und die erythrozytäre Differenzierung induziert. Hingegen führte der funktionelle Knockdown von Numb und dem homologen Numblike zu höheren Anteilen primitiver hämatopoetischer Zellen. Weiterhin deutet sich an, dass Numb in humanen HSVZ nicht als Notch-Antagonist fungiert. Zudem wurde beobachtet, dass die Überexpression von Numb zu einer Herunterregulierung von CD133 führt, einem Oberflächenmarker, der auf dem Großteil humaner CD34+ Zellen ko-exprimiert wird.
Um ein besseres Verständnis der erhaltenen Daten zu ermöglichen, entschlossen wir uns zur Analyse der Entwicklungspotenziale der Fraktionen CD34+CD133+ (CD133+) und CD34+CD133low (CD133low) in verschiedenen in vitro und in vivo Assays. Unerwarteterweise waren alle getesteten Linienpotenziale immer einer Fraktion zuzuordnen: HSVZ mit myeloischem und lymphatischem Langzeitpotenzial, CFU-GM Potenzial und SCID-repopulierende Zellen wurden nur in der CD133+ Fraktion detektiert. Hingegen fanden sich erythrozytäre, megakaryozytäre und CFU-MIX Potenziale in der CD133low Fraktion. Da Kolonien beider Fraktionen Granulozyten enthielten, wurde im Weiteren die Komposition Granulozyten-enthaltender Kolonien u. a. durchflusszytometrisch und mittels RT-PCR umfassend analysiert. Es zeigte sich, dass Neutrophile exklusiv von CD133+ Zellen gebildet wurden, während CD133low Zellen Basophile und Eosinophile hervorbringen.
Zusammenfassend deutet das im Gegensatz zum klassischen Modell, das die strikte Trennung erythro-myeloischer von lymphatischen Zellen voraussagt, auf ein neues humanes hämatopoetisches Modell hin. Demnach erfolgt die erste Linienauftrennung zwischen erythro-myeloischen (CD133low) und lymphatisch-myeloischen (CD133+) Linienpotenzialen. Somit enstehen die verschiedenen Granulozyten-Subtypen in getrennten Linien. Eosinophile und Basophile werden von erythro-myeloischen Progenitoren (EMP), Neutrophile von Zellen mit LMPP-Potenzial (lymphoid-primed multipotent progenitors) gebildet. In einem Teilprojekt wurden zur funktionellen Analyse von Numb in der Maus-Hämatopoese Numb/Numblike Knockout Mäuse generiert. Die Mäuse waren lebensfähig, und ihre Hämatopoese war nur marginal beinflusst, was nahelegt, dass Numb im hämatopoetischen System der Maus keine wichtige Rolle spielt.

Hematopoietic stem cells (HSCs) are required to sustain the daily production of billions of specialized blood cells fulfilling different functions. Even though they represent the best-studied somatic stem cell entity so far, there are many unresolved questions regarding the mechanisms that control their development including their differentiation. Preliminary studies in our group suggested that Numb, a cell fate determinant known from Drosophila as antagonist of the Notch signaling pathway, is involved in cell fate specification processes in human hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs), too.
Since the Notch signaling pathway was shown to be essentially involved in mammalian HSC maintenance, the initial aim of this thesis was to further investigate the role of Numb and to clarify its potential involvement in regulation of the Notch signaling pathway in human HSPCs, i.e. CD34+ cells. In accordance with previous results from our group, it could be demonstrated that over-expression of Numb suppresses primitive hematopoietic cell fates and induces erythroid differentiation, while the functional knockdown of Numb and its homolog Numblike increased the content of primitive hematopoietic cells. Additional experimental data indicated that Numb function in human HSPCs is independent of Notch signaling. We further observed that over-expression of Numb resulted in downregulation of CD133, a surface marker expressed on the majority of human CD34+ cells. To facilitate profound interpretation of results in this context, we decided to compare the developmental capacities of the subpopulations CD34+CD133+ (CD133+) and CD34+CD133low (CD133low) in different functional assays in vitro and in vivo. Unexpectedly, almost all lineage potentials tested turned out to be limited to one of the two subpopulations: HSPCs with long-term myeloid, long-term lymphoid and granulocyte-macrophage colony-forming (CFU-GM) potentials as well as NOD/SCID-repopulating cells exclusively were detected in the CD133+ fraction. In contrast, most cells with erythroid, megakaryocytic and CFU-MIX potentials were found in the CD133low fraction. Since granulocytes were formed within colonies from both populations, we comprehensively compared the composition of granulocyte-containing colonies by different methods including flow-cytometry and RT-PCR. We identified neutrophils to derive exclusively from CD133+ cells, while CD133low cells mainly gave rise to basophils and eosinophils.
Taken together, in contrast to the classical model that postulates the first lineage separation to occur between erythro-myeloid and lymphoid cell fates, our data suggest a revised model of human hematopoiesis. Accordingly, the first lineage branch point is marked by segregation of eythro-myeloid (CD133low) from lympho-myeloid (CD133+) potentials. Furthermore, the different granulocyte subtypes arise in distinct lineages, with eosinophils and basophils developing from erythro-myeloid progenitors (EMPs), while neutrophils develop from lymphoid-primed multipotent progenitors (LMPPs).
In another sub-project of the thesis, we generated Numb/Numblike knock-out mice to study the role of Numb in mouse hematopoiesis. The mice were viable and we detected only mild effects, indicating that Numb doesn’t seem to be essentially involved in cell fate specifictation processes in mouse HSPCs.

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Görgens, André: Funktionelle Analyse von Numb und Redefinition der humanen hämatopoetischen Hierarchie. 2013.

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