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Genexpressionsanalysen in humanen peripheren Blutlymphozyten nach Bestrahlung : Grundlagen für biodosimetrische Applikationen

Knops, Katja

Während eines radiologischen Unfalls mit Beteiligung von Personen, die nicht über physikalische Dosimeter verfügen, ist es äußerst wichtig, Individuen zu identifizieren, die mit hohen Dosen bestrahlt worden sind, um diesen eine adäquate medizinische Versorgung zu ermöglichen. Da die derzeit zur Verfügung stehenden biodosimetrischen Methoden sehr zeitaufwendig sind, sollte im Rahmen dieser Doktorarbeit eine schnelle und zuverlässige Methode zur Bestimmung der erhaltenen Dosis basierend auf Genexpressionsänderungen entwickelt werden. Dafür wurden dosis- und zeitabhängige Veränderungen der Genexpressionen in humanen peripheren Blutlymphozyten nach Hoch- und Niedrigdosisbestrahlung untersucht, um Gene zu identifizieren, die für Dosisvorhersagen in vitro geeignet sind. Außerdem sollten die Genexpressionsänderungen nach Bestrahlung einen Einblick in die biologischen Effekte ausgelöst durch Hoch- und Niedrigdosisbestrahlung liefern.
Menschliches Blut von sechs gesunden Spendern wurde dazu ex vivo mit 0, 0,5, 1, 2 und 4 Gy (Cs137 γ-Strahlung) im Hochdosisbereich und mit 0, 0,02 und 0,1 Gy im Niedrigdosisbereich exponiert. Die peripheren Blutlymphozyten wurden anschließend isoliert und kultiviert und nach 6, 24 und 48 h nach Hochdosisbestrahlung und nach 24 und 48 h nach Niedrigdosisbestrahlung wurde die lymphozytäre RNA isoliert. Die RNA wurde dazu verwendet, um Microarrays zu generieren, die dahingehend ausgewertet wurden, Genexpressionsänderungen nach Hoch- und Niedrigdosisbestrahlung zu identifizieren. Die Gene, die die robustesten Genexpressionsänderungen aufwiesen, wurden für weitere qRT-PCR-Analysen verwendet. Um die strahlenspezifische Induktion geeigneter Markergene zu testen, wurden Lymphozyten zudem mit den DNA-schädigenden Substanzen 4-Acetamidophenol und Mitomycin C für 6, 24 und 48 h inkubiert und die Genexpression ausgewählter Markergene entsprechend untersucht.
Für den Hochdosisbereich wurden 16 Gene identifiziert, die eine Genauigkeit der Dosiszuordnung in vitro von 95,7 % bis zu 48 h nach Bestrahlung erlauben. Die Genexpressionen der sieben robustesten Markergene wurden dann an gepoolten und nicht-gepoolten RNA-Proben in qRT-PCR-Messungen validiert. Zudem zeigten die qRT-PCR-Messungen, dass die starke Hochregulation der sieben Markergene strahlenspezifisch war, da diese nach Bestrahlung viel ausgeprägter als nach der Inkubation mit 4-Acetamidophenol und Mitomycin C war. Für den Niedrigdosisbereich wurden neun Markergene identifiziert, die eine Genauigkeit der Dosiszuordnung in vitro von 95,6 % erlauben. Drei dieser Gene wurden für weitere qRT-PCR-Messungen verwendet, durch welche die Genexpressionsänderungen dieser Gene nach Bestrahlung validiert wurden.
Letztlich zeigen die Ergebnisse, dass durch die Generierung von Microarrays Gene in menschlichen Lymphozyten nach Bestrahlung identifiziert werden konnten, die in vitro für biodosimetrische Applikationen nach Hoch- und Niedrigdosisbestrahlung geeignet sind.

Abstract
In case of a large-scale radiation accident with involvement of individuals without physical dosimeters it is important to identify individuals who have received a high radiation dose to ensure proper medical care. As current methods are time-consuming, a fast and reliable method based on gene expression alterations has to be developed. Therefore, in the present study dose- and time-dependent gene expression alterations were examined in human peripheral blood lymphocytes (PBL) after low- and high dose exposure to identify genes suitable for radiation dose prediction in vitro. Additionally, the gene expression experiments shall give new insights in the biological effects of high dose radiation exposure. Human blood from 6 healthy donors was irradiated ex vivo with 0, 0.5, 1, 2 and 4 Gy (γ-rays, Cs137) in the high- and with 0, 0.02 and 0.1 Gy in the low dose range. PBL were isolated and cultured for 6, 24 and 48 h after high- and for 24 and 48 h after low dose irradiation. At these times RNA was applied for processing whole human genome microarrays to analyse expression profiles. The most robust altered genes were selected for further qRT-PCR expression analysis. To examine the radiation-specificity of the candidate genes, lymphocytes were exposed to the DNA-damaging agents 4-Acetamodophenol and Mitomycin C for 6, 24 and 48 h and gene expression was accordingly analyzed.
By a p-value and fold-change driven gene selection based on microarrays 16 genes were identified after high dose exposure allowing a radiation dose prediction accuracy of 95.7% up to 48 h after irradiation. For the most robust seven genes qRT-PCR measurements based on pooled and non-pooled irradiated samples additionally validated the observed radiation-induced gene expression alterations. Furthermore, qRT-PCR analysis showed that the strong up-regulation of these genes is highly radiation-specific as the up-regulation after irradiation was much more pronounced when compared to exposure with 4-Acetamidophenol or Mitomycin C.
Microarray analysis based on low dose irradiated samples led to the identification of nine genes with which low radiation doses could be accurately predicted with a sensitivity of 95.6%. Three of these genes were selected for further qRT-PCR analysis in which gene expression alterations of these genes were validated after low dose exposure. In vitro gene expression analysis based on whole human microarray data after low- and high dose exposure of human PBL allowed identifying a rather small set of radiation dose predictive and radiation-specific genes with a high potential for biodosimetric applications in vivo.

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Knops, Katja: Genexpressionsanalysen in humanen peripheren Blutlymphozyten nach Bestrahlung. Grundlagen für biodosimetrische Applikationen. 2013.

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