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Funktionelle Charakterisierung von Neuropilin-1 in CD4+ T-Zellen

Hutzler, Marina

In einer vorangegangenen Studie konnte Neuropilin-1 (Nrp1) als spezifischen Oberflächenmarker auf murinen CD4+CD25+ regulatorischen T-Zellen identifiziert werden (Bruder et al., 2004). Über die Funktion von Nrp1 auf CD4+ T-Zellen gibt es aber nach wie vor nur wenige Erkenntnisse. Aktuelle Studien suggerieren, dass Nrp1 die Interaktion zwischen CD4+ T-Zellen und dendritischen Zellen moduliert (Sarris et al., 2008), als Rezeptor, sowohl für die latente, als auch für die aktive Form von TGF-beta fungiert (Glinka and Prud'homme, 2008), und dass Nrp1 zur Funktion regulatorischer T-Zellen in einem Modell für Entzündung im zentralen Nervensystem der Maus beiträgt (Solomon et al., 2011). Die Ergebnisse dieser Arbeit verschaffen einen tieferen Einblick in die Funktion von Nrp1 auf CD4+ T-Zellen. Untersuchungen an einer transgenen Mauslinie, die Nrp1 spezifisch in CD4+CD25- T-Zellen überexprimiert (CD4-Nrp1), liefern erste Hinweise auf eine Rolle von Nrp1 in der Modulation der T-Zellrezeptor-abhängigen Signalkaskade. Vergleichende Genexpressionsanalysen von in vitro stimulierten CD4+CD25- T-Zellen dieser Mäuse ergaben eine reduzierte Expression von Genen, die mit der Aktivierung des T-Zellrezeptors assoziiert werden. Auch Realtime PCR und FACS-Analysen von in vitro stimulierten CD4+CD25- T-Zellen aus CD4-Nrp1 Mäusen zeigten eine tendenziell, nicht aber signifikant, reduzierte Aktivierung im Vergleich zu Zellen aus WT Tieren. Außerdem kam es durch die transgene Expression von Nrp1 zu einer leichten Reduktion der proliferativen Kapazität der CD4+ T-Zellen in vitro. Interessanterweise konnte eine suppressive Aktivität in vitro durch die Überexpression von Nrp1 in CD4+CD25- T-Zellen nicht induziert werden. Hingegen zeigte sich aber nach dem Transfer in ein Autoimmunmausmodell eine leichte Akkumulation der Nrp1-überexprimierenden T-Zellen in dem Gewebe, dass ihr spezifisches Antigen exprimiert. Weiterführende Analysen an Mäusen, in denen die Expression von Nrp1 spezifisch in CD4+ T-Zellen ausgeschalten ist (Nrp1-KO) konnten eine entscheidende Rolle von Nrp1 an der Migration von Tregs belegen. Obwohl Co-Kultur Experimente zeigten, dass die suppressiven Fähigkeiten von CD4+CD25+ T-Zellen durch die Deletion von Nrp1 nicht beeinträchtigt werden, kam es in Nrp1-KO Mäusen zu einem bemerkenswerten Phänotyp in der Tumorentstehung. Dieser äußert sich, ebenso wie in Mäusen, in denen Nrp1 spezifisch in Foxp3+ Tregs ausgeschaltet ist (FIC-Nrp1-KO), in signifikant verlangsamtem Tumorwachstum, begleitet von erhöhter Rekrutierung und Aktivierung von CD8+ T-Zellen in den Tumor. Hingegen konnte eine reduzierte Infiltration von CD4+Foxp3+ Tregs in den Tumor festgestellt und auf die Interaktion zwischen Tumor-sekretiertem VEGF und auf den Tregs exprimiertem Nrp1 zurückgeführt werden. Insgesamt konnte in der vorliegenden Arbeit gezeigt werden, dass Nrp1 an der Migration von Tregs in Abhängigkeit von VEGF beteiligt ist. Inwieweit dies einen Tumor-spezifischen Mechanismus darstellt, oder ob dieser auch im Verlauf anderer Immunantworten eine Rolle spielt, soll in zukünftigen Studien geklärt werden.

In a preceding study, Neuropilin-1 (Nrp1) could be identified as a specific surface marker of murine CD4+CD25+ regulatory T cells (Bruder et al., 2004). Still, only little is known about the function of Npr1 on CD4+ T cells. Recent studies suggest, that Nrp1 modulates the interaction between CD4+ T cells and dendritic cells (Sarris et al. 2008), acts as a receptor for the latent as well as for the active form of TGF-beta (Glinka and Prud’homme, 2008), and that Nrp1 contributes to the function of regulatory T bcells in a model of inflammation of the central nervous system in mice (Solomon et al., 2011). The results of this study provide deeper insight into the function of Npr1 on CD4+ T cells. Analyses of a transgenic mouse line, over expressing Nrp1 specifically in CD4+CD25- T cells (CD4-Nrp1), offer first evidence for a role of Nrp1 in the modulation of the T cell receptor-dependent signaling cascade. Gene expression analyses of in vitro stimulated CD4+CD25- T cells of these mice showed a reduced expression of genes, associated with the activation of the T cell receptor. Furthermore, Realtime PCR and FACS analyses of in vitro stimulated CD4+CD25- T cells from CD4-Nrp1 mice tended to, but not significantly showed reduced activation compared to cells from WT animals. Besides, the transgenic expression of Nrp1 led to a slight reduction of the proliferative capacity of CD4+ T cells in vitro. Interestingly, suppressive activity in vitro could not be induced by over expressing Npr1 in CD4+CD25- T cells. However, upon transfer into an autoimmunity mouse model, a slight accumulation of Nrp1 over expressing T cells in the tissue, expressing their cognate antigen, could be observed. Further analyses in mice, in which Nrp1 expression is knocked out specifically in CD4+ T cells (Nrp1-KO) could reveal a pivotal role of Nrp1 in the migration of Tregs. Although co-culture experiments showed, that the suppressive capacity of CD4+CD25+ T cells is not affected by the deletion of Nrp1, Nrp1-KO mice showed an impressive phenotype during tumor development. As well as mice, in which Nrp1 is deleted specifically in Foxp3+ Tregs (FIC-Nrp1-KO), these mice show a significantly reduced tumor growth, accompanied by increased recruiting and activation of CD8+ T cells in the tumor. On the contrary, a reduced infiltration of CD4+Foxp3+ Tregs into the tumor could be determined and ascribed to the interaction of tumor-secreted VEGF and Nrp1 expressed by Tregs. In summary, this thesis could show that Nrp1 is involved in the migration of Tregs in dependency on VEGF. In how far this is a tumor-specific mechanism, or if it also plays a role in the course of other immune responses, shall be assessed in forthcoming studies.

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Hutzler, Marina: Funktionelle Charakterisierung von Neuropilin-1 in CD4+ T-Zellen. 2012.

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