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Functions of the MRE11-RAD50-NBS1 complex in DNA double strand break repair

Konkow, Swetlana

In a living organism maintenance of genomic stability and integrity is of extreme importance. Thus, any chemical change in the cellular deoxyribonucleic acid (DNA) molecule is considered as damage. Among various forms of DNA damage the DNA double stand break (DSB) is the most deleterious DNA lesion, since if misrepaired or left unrepaired it can cause loss or rearrangement of genetic material. This can lead to permanent cell cycle arrest, apoptosis, mutations, genomic instability and with that to a variety of diseases ranging from genetic disorders, chronic diseases, cancer and accelerated ageing (Ward 1988; Olive 1998; Khanna and Jackson 2001; van Gent, Hoeijmakers et al. 2001; d'Adda di Fagagna, Reaper et al. 2003).
To deal with these assaults, cells have evolved sophisticated mechanisms to efficiently detect, signal and repair DNA damage and thus to maintain genomic integrity (Shiloh and Lehmann 2004). Eukaryotic cells have at least two pathways to repair DSBs: (1) non-homologous end-joining (NHEJ) and (2) homologous recombination repair (HRR) (Kanaar, Hoeijmakers et al. 1998; Pardo, Gómez-González et al. 2009). In addition, an extensive signaling network, comprising several different proteins, recognizes DSBs and coordinates repair pathways with cellular checkpoint responses, commonly summarized under the term – DNA damage response (DDR).
In summary, our results confirmed that following IR, MRN forms, in fixed and live cells, nuclear foci, which comprised the entire MRE11-RAD50-NBS1 protein complex, and which localized at the sites of DSBs. However, the results obtained also provided new insights. To date, we are the first to show a bimodal cell cycle-independent MRN IRIF response with different MRE11 foci patterns, using different radiation modalities. We documented small MRE11 IRIF mainly forming at early time points and which later developed to larger MRE11 foci. Notably, after high LET irradiation the initial MRE11 IRIF response mostly included large MRE11 foci.
These observations indicated that the dynamic assembly of large MRE11 foci may be required for the repair of particularly complex and difficult to repair DSBs induced by high LET irradiation or by high doses of low LET radiation. We concluded that complex DSBs induced by high LET radiation changed the accretion characteristics of MRE11. Moreover, we confirmed an inter-dependent function of MRE11 and ATM to IR, as ATM influenced MRN’s ability to localize to nuclear foci and vice versa. However, the colocalization analysis of -H2AX and MRE11 IRIF suggested functionally distinct modes of MRE11’s activity in DDR, as MRE11 clearly localized to sites of -H2AX but could be found only at a subset of DSBs.
In addition, our results unveiled the contribution of MRN to different DSB repair pathways, and confirmed that MRN acts as a repair factor in several of them. Specifically, we showed that MRN and ATM deficiency had a dramatic impact on HRR. Thus, in cells with defective MRN or ATM, DNA end resection was initiated but repair remained incomplete. On the other hand, we could not detect a contribution of MRE11 to DSB repair by D-NHEJ. However, we were able to show that MRN plays a major role in DSB repair by B-NHEJ. These results in aggregate provided strong evidence that MRN is not involved in all DSB repair pathways, as it is occasionally anticipated in published reports. The MRN complex seems to specifically function in HRR and B-NHEJ, where DNA end processing is an essential or a likely step. In addition, we demonstrated a clear effect of DNA-PKcs in DDR, as higher and longer persisting MRE11 foci numbers were detected in DNA-PKcs-deficient cells. In addition, we showed that DNA-PK not only plays a role in D-NHEJ but also has a function in HRR. Specifically, we detected a higher initiation of HRR in KU-deficient cells and, more interestingly, incomplete HRR in DNA-PK-deficient cells.

In einem lebenden Organismus ist die Aufrechterhaltung der genomischen Stabilität und Integrität von äußerster Wichtigkeit. So wird jede chemische Veränderung des zellulären Desoxyribonucleinsäure (DNA) als Schaden angesehen. Unter den verschiedensten Formen des DNA-Schadens, ist der DNA-Doppelstrangbruch (DSB) besonders hervor zu heben, denn wenn dieser fehlerhaft repariert wird oder sogar gänzlich unrepariert bleibt, kann es zum Verlust oder Veränderung des genetischen Materials kommen. Dies kann zum dauerhaften Zellzyklusstop, Apoptose, Mutationen, genomischer Instabilität und damit zu einer Vielzahl von genetischen Erkrankungen kommen, z.B. chronische Erkrankungen, Krebs und vorzeitiges Altern. Für eine effiziente Erkennung solchen Schadens sind in eukaryotischen Zellen komplexe Mechanismen entstanden, so dass die genomische Integrität erhalten wird. Eukaryotische Zellen haben mindestens zwei Wege zur DSB-Reparatur: (1) nicht-homologe Endverknüpfung (NHEJ) und (2) homologe Rekombinationsreparatur (HRR). Darüber hinaus erkennt ein umfangreiches Signalisierungsnetzwerk, bestehend aus mehreren unterschiedlichen Proteinen, z.B. dem MRE11-RAD50-NBS1 (MRN)-Komplex, die DSBs und koordiniert die Reparaturwege mit den zellulären „Checkpoint“-Antworten; weiter unter dem Begriff „DNA damage response“ (DDR) zusammengefasst.
In dieser Arbeit konnten wir bestätigen, dass nach Bestrahlung mit ionisierender Strahlung, sich MRN Protein-Foci (IRIF) im Zellkern fixierter und lebender Zellen ausbildeten, die aus dem gesamten MRN-Komplex bestehen und an Orten der DSBs lokalisiert werden konnten. Des Weiteren konnten wir auch neue Erkenntnisse präsentieren. So sind wir bis jetzt die Ersten, die eine bimodale zellzyklusunabhängige MRN-IRIF-Antwort mit verschiedenen MRE11-Foci-Mustern, nach Bestrahlung mit verschiedenen Strahlenarten, zeigen. Wir dokumentieren kleine MRE11 IRIF zu frühen Zeitpunkten, die sich später zu großen MRN Foci entwickelten. Bemerkenswert ist, dass nach Bestrahlung mit hohem „linear energy transfer“ LET, meist nur größere MRE11 Foci sich ausbildeten. Diese Beobachtungen zeigen, dass der dynamische Zusammenbau von großen MRE11 Foci von besonderer Bedeutung für die Reparatur von sehr komplexen und schwer zu reparierenden DSBs ist, vor allem nach Bestrahlung mit Hoch-LET und hohen Dosen von niedrigem LET. Wir schlossen daraus, dass komplexe DSBs, die meist durch Hoch-LET Strahlung induziert werden, die Anlagerungseigenschaften von MRE11 verändern. Darüber hinaus bestätigen wir hier eine inter-abhängige Funktion von MRE11 und ATM nach Bestrahlung, da ATM die MRN-Foci-Formierung und auch umgekehrt beeinflussten. Zudem konnten wir mit Hilfe einer Colokalisationsanalyse von γ-H2AX und MRE11 Foci eine funktionell unterschiedliche Funktion von MRE11 in der DDR aufzeigen, da MRE11 nur an einigen DSBs lokalisierte.
Darüber hinaus konnten unsere Ergebnisse den Beitrag von MRN zu den unterschiedlichen DSB-Reparaturwegen aufklären und bestätigten, dass MRN als Reparaturfaktor in mehreren von ihnen beteiligt ist. Insbesondere zeigen wir, dass MRN-und ATM-Mangel einen dramatischen Einfluss auf die HRR hatte. So wird in Zellen mit defektem MRN oder ATM, die DNA-Endresektion eingeleitet, doch die Reparatur blieb unvollständig. Auf der anderen Seite konnten wir einen Beitrag von MRE11 zur DSB-Reparatur durch D-NHEJ nicht erkennen. Allerdings waren wir in der Lage zu zeigen, dass MRN eine wichtige Rolle in der DSB-Reparatur durch B-NHEJ spielt. Zusammengefasst belegen diese Ergebnisse eindeutig, dass MRN nicht in allen DSB-Reparaturwegen beteiligt ist, wie es gelegentlich in veröffentlichten Berichten diskutiert wird. Der MRN-Komplex scheint speziell in der HRR und der B-NHEJ, wo DNA-Endresektion eine wichtige Rolle spielt, beteiligt zu sein.
Darüber hinaus konnten wir einen Einfluss der DNA-PKcs in DDR aufzeigen, da eine höhere und länger anhaltende MRE11 Focianzahl in DNA-PKcs-defizienten Zellen dokumentiert wurde. Des weiteren haben wir zeigen können, dass die DNA-PK nicht nur eine Rolle bei der D-NHEJ spielt, sondern auch eine Funktion in der HRR hat. Insbesondere konnten wir eine höhere Einleitung der HRR in KU-defezienten Zellen und interessanterweise eine unvollständige HRR in DNA-PK-defizienten Zellen aufweisen.

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Konkow, Swetlana: Functions of the MRE11-RAD50-NBS1 complex in DNA double strand break repair. 2012.

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