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Identifikation von Zelloberflächenproteinen zur Beschreibung der Hierarchie endothelialer Vorläuferzellen

Horsch, Liska

ECFCs stellen eine in vitro effizient expandierbare neue endotheliale Zellquelle dar. Die Proliferationseigenschaften und die morphologische Veränderung von ECFCs in vitro weist auf eine hierarchische Entwicklung dieser hin. Die verschiedenen hierarchischen Entwicklungsstufen sollten daher durch spezifische Kombinationen von unterschiedlich exprimierten Oberflächenproteinen dargestellt werden.
Das Oberflächenprotein CD34 wird heterogen auf ECFCs exprimiert. Im Verlauf dieser Arbeit wurde ein Antikörper-basiertes Screening gegen 106 Oberflächenantigene durchgeführt, durch das weitere heterogen exprimierte Marker identifiziert werden sollten. Von den 106 untersuchten Oberflächenproteinen werden 29 auf der Zelloberfläche von ECFCs exprimiert, 13 dieser Oberflächenmarker weisen eine heterogene Expression gegen CD34 auf. Die Oberflächenantigene CD13, CD31, CD40, CD54, CD63, CD102, CD123 und VEGF-R2 waren auf den CD34 positiven Zellen stärker exprimiert, als auf den CD34 negativen/schwach positiven Zellen (Gruppe 1). Die höchste Expression der Oberflächenantigene CD44, CD146, CD151, CD166 und CD252 wurde auf den CD34 negativen Zellen nachgewiese (Gruppe 2). Die stärkste Auftrennung verschiedener ECFC-Linien gelang mit den Antikörpern gegen das Oberflächenantigen CD34 aus der Gruppe 1 und gegen das Oberflächenantigen CD44 aus der Gruppe 2, wobei die drei Subpopulationen CD44++CD34-, CD44+CD34- und CD44+CD34+ definiert wurden.
Übereinstimmend mit der Annahme, dass die CD44+CD34+ Subpopulation die reiferen Progenitoren beinhaltet, wiesen die Zellen der CD44+CD34+ Subpopulation das geringste Expansionspotential auf. Weiterhin wurde der höchste Anteil an mehrkernigen Zellen innerhalb der CD44+CD34+ Subpopulation nachgewiesen, ein weiterer Indikator für die Differenzierung dieser Zellen. Die Ergebnisse dieser Arbeit lassen die Möglichkeit offen, ob sich in der CD44++CD34- Zellfraktion -neben einer Subpopulation primitiver ECFCs- eine Subpopulation von ECFCs befindet, die für eine Umwandlung von CD44++CD34- zu CD44+CD34- und umgekehrt verantwortlich ist. Zur Untersuchung des klonogenen Potentials der Subfraktionen wurden einzelne Zellen kultiviert und ihre Fähigkeit, Kolonien auszubilden, untersucht. Hierbei besaßen die Zellen der CD44++CD34- Zellfraktion das höchste Kolonie-bildende Potential und die höchste Zellteilungsrate im Vergleich zu den Zellen der CD44+CD34- und CD44+CD34+ Zellfraktionen. Mit der Hilfe von CD34 und CD44 können ECFCs und HUVECs unterschiedlicher hierarchischer Entwicklungsstufen erfolgreich voneinander unterschieden werden.
Im Rahmen dieser Arbeit wurde untersucht, ob Komponenten des Notch-Signalwegs Einfluss auf das Zellschicksal endothelialer Vorläuferzellen ausüben. Durch die Verwendung eines lentiviralen Systems wurden Untersuchungen zum Funktionszugewinn und Funktionsverlust entsprechender Mediatoren des Notch-Signalwegs (NICD1, Hey1, Hey2 und Hes1) und der Zellschicksalsdeterminanten Numb und Numblike durchgeführt.
Ein erhöhter Anteil CD34+ Zellen wurde in der Zellfraktion der NICD1 exprimierenden und Hey1, Hey2 und Hes1 überexprimierenden Zellen nachgewiesen, wohingegen im Mittel ein erhöhter Anteil an CD44++ Zellen innerhalb der Numb und Numblike überexprimierenden Zellen nachgewiesen werden konnte. Übereinstimmend mit der Implikation, dass das Oberflächenantigen CD34 hauptsächlich auf reifen Endothelzellen exprimiert wird, wiesen die Notch-aktiven HUVECs im Vergleich zu den Kontrollzellen eine verringerte Koloniebildungs- und Zellteilungsrate auf. Im Gegensatz dazu wurde die höchste Koloniebildungs- und Zellteilungsrate innerhalb der Numb- und Numblike überexprimierenden Zellen gefunden. Diese Ergebnisse führen zu der Annahme, dass die Mitglieder des Notch-Siganlwegs die Differenzierung von endothelialen Vorläuferzellen initiieren, wohingegen Numb und Numblike die Primitivität der Zellen erhält.

ECFCs are a novel entity of endothelial cells, which can be efficiently expanded in vitro. Regarding their proliferation rate and morphology, ECFCs seem to be organized in a hierarchical manner. We hypothesize that putative hierarchical levels are reflected by specific combinations of cell surface proteins and define different ECFC subpopulations.
Previously, the cell surface protein CD34 was recognized as a marker that is heterogeneously expressed on ECFCs. In the course of this study we aimed to identify additional markers and performed a cell surface-based antibody screen recognizing 106 different cell surface antigens. Out of those, 29 cell surface proteins were found to be expressed on ECFCs, and 13 of them revealed a heterogeneous expression. Considering the distribution of CD34 expression in relation to each of these 13 marker proteins, two different subgroups of ECFCs were established. While CD34-positive cells revealed the highest expression of members of one group, ECFCs with the strongest expression of members of the other group were found within the CD34-negative cell fraction. Due to the fact that CD34 and CD44 as representatives of both subgroups showed the highest heterogeneous contrast within their groups, we decided to use CD34 and CD44 staining for further analysis, defining the three subpopulations of CD44++CD34, CD44+CD34- and CD44+CD34+ cells. The subpopulation of CD44+CD34+ cells showed the lowest expansion potential and in agreement with our implication that the CD44+CD34+ population contains mainly mature endothelial cells, they displayed the highest content of polynuclear cells, which is another indication for their maturity. Therefore, we conclude that the CD44+CD34+ cell fraction consists mainly of mature endothelial cells. Our results displayed that CD44++ can convert into CD44+ and vice versa. Therefore, we propose that the CD44++CD34- fraction contains two subpopulations: a) a more mature subpopulation which is responsible for the conversion of the CD44+CD34- fraction and b) a more primitive ECFC cell fraction. Therefore, no obvious relationship between these two subpopulations could be observed within these bulk analyses. The most rigorous test for the clonogenic potential of progenitors is to determine whether a single cell will form a colony in the absence of other cells. At this, the CD44++CD34- cells showed the highest colony-forming frequency and in average formed bigger colonies than cells of the CD44+CD34- and CD44+CD34+ cells when seeded as single cells.
We demonstrate that a hierarchy of progenitor cells can be identified in ECFCs derived from umbilical cord blood and discriminated them by their cell surface expression of the cell surface antigens CD34 and CD44. In the course of this study we also tried to identify factors being involved in controlling self-renewal versus differentiation processes in this hierarchical system. The functional impact of the intrinsic factors of the notch signalling pathway (Notch1ICD, Hey1, Hey2 and Hes1) and of the cell fate determinats Numb and Numblike were analysed by performing overexpression or mediated knockdown experiments by lentiviral transduction of endothelial progenitor cells. We could demonstrate that on the one hand the highest amount of CD34 positive cells were detected within the Notch1ICD, Hey1, Hey2 and Hes1 lentiviral tranduced cell fraction and on the other hand the highest amount of CD44++CD34- cells were observed within the Numb lentiviral tranduced cell fraction. In agreement with our implication that the cell surface antigen CD34 is mainly expressed on mature endothelial cells, we could demonstrate that the Notch1ICD, Hey1, Hey2 and Hes1 lentiviral tranduced cells showed the lowest colony-forming frequency, the lowest cumulative population doublings rate and are subjected selective disadvantage when compared to the control cells. In contrast, the highest colony-forming frequency, the highest cumulative population doublings rate and a selective advantage of Numb and Numblike lentiviral transduced cells could be observed when compared with the control cells. These results lead to the assumption, that the members of the notch signaling pathway initiates maturation whereas Numb and Numblike initiates primitiveness of ECFCs.

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Horsch, Liska: Identifikation von Zelloberflächenproteinen zur Beschreibung der Hierarchie endothelialer Vorläuferzellen. 2012.

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