DuEPublico 2

Dies ist unser neues Repositorium, derzeit für E-Dissertationen und ausgewählte weitere Publikationen. Weitere Informationen...

Identification and characterization of posttranslational modifications on CenH3 in Saccharomyces cerevisiae

Samel, Anke

The centromeric region in all eukaryotes is characterized by the presence of a histone H3 variant that replaces the canonical histone H3 in centromeric nucleosomes. In the budding yeast Saccharomyces cerevisiae, the centromeric histone H3 variant, termed Cse4, is present in a single nucleosome that forms the centromeric structure. The centromeric nucleosome serves as a platform for the assembly of the kinetochore, which ensures the faithful transmission of the genetic information to the daughter cell during the cell cycle. In this study, we identified posttranslational modifications on Cse4 and characterized their contribution to centromere function. We could show for the first time that Cse4 is posttranslationally modified by phosphorylation on serine 33, methylation on arginine 37 and acetylation on lysine 49. Methylation on arginine 37 as well as the acetylation on lysine 49 of Cse4 were determined both by mass spectrometry and by modification-specific Cse4 antibodies. A further analysis of mutations of the modified sites in the N-terminus of Cse4 showed no significant effect in the wild-type. Interestingly, the mutation of Cse4 R37 displayed lethality as well as growth defects in combination with mutations of genes encoding several kinetochore components. Furthermore, cse4-R37A caused a defect in the G2/ M-phase of thecell cycle in the absence of the Cbf1 kinetochore protein as well as a maintenance defect of plasmids and chromosome fragments lacking the Cbf1 binding sequence, CDEI. These results indicated that the methylation on arginine 37 of Cse4 contributed to the regulation of chromosome segregation. While Cse4 methylation did not affect its deposition at the centromere, the mutation of Cse4 R37 significantly reduced the recruitment of two kinetochore proteins to the centromeric region. Together with the fact that the level of Cse4 R37 methylation was increased in S-phase arrested cells, these results suggest that the methylation on arginine 37 of Cse4 supports the recruitment of kinetochore components to the centromere. Surprisingly, the additional mutation of lysine 49 to arginine led to the suppression of the growth defects of cse4-R37A suggesting an antagonistical effect between both modification sites. In summary, our data show that the centromeric histone H3 variant is posttranslationally modified, and that the methylation on arginine 37 of Cse4 contributes to the recruitment of kinetochore proteins to build a functional kinetochore for accurate chromosome segregation.

Die zentromerische Region in der Bäckerhefe Saccharomyces cerevisiae zeichnet sich durch ein einzelnes Nukleosom aus, an dem das Kinetochor bindet. Wie in allen Eukaryoten, wird hier das kanonische Histon H3 durch eine zentromerische Histon H3 Variante ersetzt, welche als Cse4 bezeichnet wird. Diese Struktur ermöglicht die Assemblierung des Kinetochors und garantiert die Weitergabe der genetischen Information an die Tochterzellen während der Mitose. In der vorliegenden Arbeit wurden posttranslationale Modifikationen an Cse4 ermittelt und deren Rolle in der Chromosomensegregation untersucht. Dabei konnte zum ersten Mal gezeigt werden, dass Cse4 posttranslational durch Phosphorylierung am Serin 33, Methylierung am Arginin 37 und Acetylierung am Lysin 49 modifiziert wird. Sowohl durch Massenspektrometrie als auch durch modifikationsspezifische Cse4 Antikörper konnten die Methylierung am Arginin 37 und die Acetylierung am Lysin 49 nachgewiesen werden. Weitere Untersuchungen zeigten, dass die Mutation der Modifikationsstellen im Cse4 keinen Phänotyp in Wildtypzellen zeigte. Jedoch führte die Mutation von Arginin 37 in Stämmen, in denen einzelne Kinetochorproteine mutiert wurden, zu Letalität und Wachstumsdefekten. Interessanterweise führte die Mutation von Cse4 R37 zu einem mitotischen Effekt inAbwesenheit des Kinetochorproteins Cbf1 und zu einem erhöhten Plasmid- und Chromosomenverlust von Fragmenten ohne Cbf1 Bindesequenz (CDEI). Diese Ergebnisse zeigten, dass die Methylierung von Arginin 37 eine Rolle während der Chromosomensegregation spielt. Außerdem konnte gezeigt werden, dass die Argininmethylierung keinen Einfluss auf die Lokalisation des Proteins am Zentromer hat, jedoch führte die Mutation von Cse4 R37 zu einer geringeren Assoziation zweier Kinetochorproteine am Zentromer. Zusätzlich dazu wurde eine erhöhte Methylierung am Arginin 37 in S-phase arretierten Zellen beobachtet. Dies deutete darauf hin, dass die Argininmethylierung eine Rolle in der Rekruitierung des Kinetochors zum Zentromer spielt. Überraschenderweise führte die zusätzliche Mutation vom Lysin 49 zu Arginin zu einer Suppression des Wachstumsdefekts von cse4-R37A, welches auf einen möglichen antagonistischen Effekt zwischen beiden Modifikationsstellen hindeutet. Zusammenfassend konnte in dieser Arbeit gezeigt werden, dass die zentromerische Histon H3 Variante posttranslational modifiziert wird und die Methylierung am Arginin 37 eine entscheidende Rolle in der Rekruitierung und Formierung des Kinetochors übernimmt um somit eine korrekte Chromosomensegregation zu gewährleisten.

Vorschau

Teilen und Zitieren

Zitierform:

Samel, Anke: Identification and characterization of posttranslational modifications on CenH3 in Saccharomyces cerevisiae. 2015.

Rechte

Nutzung und Vervielfältigung:
Alle Rechte vorbehalten

Export