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Characterization of the Dnmt2 homolog Pmt1 in Schizosaccharomyces pombe

Becker, Maria

DNA nucleotide methyltransferases (Dnmts) are the enzymes responsible for the conversion of cytosine to 5-methylcytosine in eukaryotes. The fission yeast Schizosaccharomyces pombe contains a putative DNA methyltransferase, termed pombe methyltransferase1 (Pmt1) that belongs to the Dnmt2 family of cytosine methyltransferases, but intriguingly has no DNA methylation. Dnmt2 family members from several organisms have been demonstrated to methylate tRNAAsp at position C38 rather than cytosines in DNA, but the biological function of this tRNA modification has remained largely unknown. In this study, we found that Pmt1 is able to methylate position C38 of tRNAAsp and to a lesser extent tRNAGlu in vitro using methylation of tRNA transcripts by recombinant Pmt1. RNA bisulfite sequencing of tRNAs showed that Pmt1 is also active in vivo. These results show that mt1 in principle has methyltransferase activity, although it was previously thought to be inactive due to a deviation in catalytic motif IV from other Dnmt2 enzymes. Furthermore, in vivo Pmt1 activity was strongly influenced by a nutritional factor in the growth medium. Induction of Pmt1 methyltransferase activity was observed upon the addition of peptone to S. pombe growth medium. Furthermore, the induction of Pmt1 activity required the serine/threonine kinase Sck2 and was independent of the kinases Sck1, Pka1 and Tor1. Significantly, cells with full tRNA methylation displayed a shortened chronological lifespan, whereas the deletion of pmt1+ lead to an elongated lifespan in fission yeast. In summary, out data show that Pmt1 is an active tRNA methyltransferase. Furthermore, Pmt1 function is regulated in a nutrient-dependent manner by the serine/threonine kinase Sck2, and it is involved in the regulation of chronological aging in the fission yeast Schizosaccharomyces pombe.

DNA Methyltransferasen (Dnmts) in Eukaryoten katalysieren die Umwandlung von Cytosin zu 5-Methylcytosin. Die Spalthefe Schizosaccharomyces pombe besitzt eine mögliche DNA Methyltransferase namens Pombe Methyltransferase1 (Pmt1), die zur Familie der Dnmt2 Enzyme gehört, besitzt jedoch keine nachweisbare DNA Methylierung. Dnmt2 Homologe aus verschiedenen Organismen sind in der Lage, tRNAAsp an Position C38 zu methylieren und zeigen vergleichsweise geringe DNA Methylierungsaktivität. Die biologische Funktion dieser tRNA-Modifikation ist bisher kaum erforscht. Unsere Ergebnisse aus in vitro Methylierungsanalysen mit rekombinantem Pmt1 zeigen, dass das S. pombe Homologe von Dnmt2 in der Lage ist, tRNAAsp und tRNAGlu aus der Spalthefe zu methylieren. Diese Resultate demonstrieren, dass Pmt1 ein aktives Enzym ist, obwohl frühere Untersuchungen nahe legten, dass eine Abweichung von der Konsensussequenz der Dnmt2 Enzyme im katalytischen Motiv IV zu einer Inaktivierung des Enzyms geführt hat. Mittels der RNA Bisulfit-Sequenzierung konnten wir diese Aktivität auch in vivo zeigen. Interessanterweise zeigten unsere Untersuchungen, dass die Aktivität von Pmt1 durch die Nährstoffe im Kultivierungsmedium reguliert wird. Die Methyltransferaseaktivität von Pmt1 wurde induziert, wenn dem S. pombe Vollmedium Pepton zugesetzt wurde. Des Weiteren konnten wir zeigen, dass für die Induktion der Pmt1-Aktivität die Serin/Threonin- Kinase Sck2 benötigt wird, wohingegen die Kinasen Sck1, Pka1 und Tor1 keinen Einfluß auf die Pmt1-abhängige tRNA-Methylierung hatten. Schließlich konnten wir außerdem zeigen, dass Hefezellen, die eine starke tRNA-Methylierung aufweisen, eine verkürzte chronologische Lebensspanne besitzen. Die Deletion des pmt1+-Gens führt hingegen zu einer Verlängerung der Lebensspanne der S. pombe Zellen. Zusammengefasst zeigen unsere Daten, dass Pmt1 eine aktive tRNA Methyltransferase ist, dass die Funktion von Pmt1 nährstoffabhängig von der Serin/Threonin kinase Sck2 reguliert wird, und dass Pmt1 an der Regulation der chronologischen Alterung in der Spalthefe Schizosaccharomyces pombe beteiligt ist.

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Becker, Maria: Characterization of the Dnmt2 homolog Pmt1 in Schizosaccharomyces pombe. 2013.

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