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Die Amyloidablagerung in einem Mausmodell der Alzheimer Demenz und die Modulation der β-Amyloid-Peptidentstehung durch membranverankerte Inhibitoren

Schieb, Heinke

Die genaue Pathogenese der Alzheimer Demenz ist noch ungeklärt, doch wird angenommen, dass die Aggregation und Akkumulation von bestimmten Formen des Aβ-Peptides den Auslöser für die nachfolgenden pathologischen Mechanismen bildet. Als experimentelle Modelle für die charakteristische Amyloidpathologie der Alzheimer Demenz und für die Untersuchung von möglichen auf β-Amyloid (Aβ)abzielenden Therapieansätzen, werden häufig transgene Mäuse eingesetzt, die mutierte Varianten des Amyloid-Vorläufer-Proteins (APP) exprimieren.
In einem ersten Teilprojekt dieser Arbeit sollte die altersabhängige Amyloidpathologie der APP23 Mäuse, die humanes APP mit der schwedischen Mutation exprimieren, biochemisch untersucht werden und mit humanen Alzheimer Proben verglichen werden. Ein Schwerpunkt sollte dabei der Analyse verschiedener Modifikationen des Aβ-Peptides gelten. In den APP23 Mäusen, wurde ein exponentieller zeitlicher Verlauf der Aβ-Akkumulation beobachtet, der im Einklang steht mit der „Keim-Theorie“ für die Aggregation von amyloidogenen Proteinen. Es zeigten sich grundlegende Unterschiede in der Zusammensetzung der amyloiden Ablagerungen zwischen Maus und Mensch. Während beim Menschen hautpsächlich Aβ42 abgelagert wurde, war die Hauptmenge bei der Maus das am C-Terminus um zwei Aminosäurereste kürzere Aβ40. Des Weiteren enthielten die humanen Plaques verschiedene N-terminal trunkierte Aβ Variationen, von denen eine Aβ-Form, die an Position 3 mit einem Pyroglutamat beginnt, die Hauptmenge darstellte. Diese konnten auch in den APP23 Mäusen nachgewiesen werden, jedoch in weitaus geringeren Mengen als beim Menschen. Dies verdeutlicht, dass die APP23 Mäuse die humane Amyloidpathologie nur unvollständig abbilden.
Aufgrund der biophysikalischen Eigenschaften des hydrophoben, zur Aggregation neigenden Aβ-Peptides ergaben sich methodische Schwierigkeiten. Deshalb wurde eine Extraktionsmethode, die für die Extraktion von Aymloidproteinen bei peripheren Amyloidosen entwickelt wurde, modifiziert und erstmals auf die Gewebextraktion von Aβ angewendet. Dadurch gelang es, das Amlyoid aus dem Gewebe in Reinstwasser zu lösen und die fibrilläre Struktur im Elektronenmikroskop darzustellen. Kontaminationsproblemen bei der 2DE durch adhäsive Aβ-Peptide, wurden durch die Entwicklung eines mehrstufigen Reinigungsprotokolls, das die Behandlung mit Proteinase K einschließt, begegnet.
In einem zweiten Teilprojekt sollten in primären neuronalen Zellen und in Zelllinien membranverankerte BACE Inhibitoren mit verschiedenen Pharmakophoren, unterschiedlichen Linkerlängen und Variationen von Lipid-Ankern charakterisiert werden. BACE ist die hauptsächliche β-Sekretase, die enzymatische Aktivität, die den ersten Schritt bei der Aβ-Generierung katalysiert. Der mittels Dihydrocholesterol und einem 89 Å Linker in der Membran verankerte Inhibitor war in allen Zellmodellen weitaus effektiver als der entsprechende freie Inhibitor in der Reduktion der Menge an sezernierten Aβ-Peptiden. Es zeigte sich, dass Inhibitoren, die einen Anker enthielten, der vornehmlich in „Lipid Raft“ inserierte, effektiver waren als andere, weniger oder nicht „raftophile“ Lipid-Anker. Zusätzlich konnte durch Anpassung des Abstandes des Inhibitors von der Membran, der Inhibitor weiter optimiert werden. Interessanterweise hatten die Inhibitoren unterschiedliche Effekte auf Wild-Typ APP und auf APP mit der schwedischen Doppelmutation, die sich direkt vor der β-Sekretase Schnittstelle im APP befindet. Auch entstanden in der Gegenwart von BACE-Inhibitoren aus APP Wild-Typ geringe Mengen an Aβ-Peptiden, die möglicherweise modifizierte N-Termini aufwiesen und nicht in den mit APPsw transfizierten Zellen detektiert wurden. Da N-terminal modifizierte und / oder verkürzte Aβ-Peptide einen großen Anteil in humanen Plaques ausmachen, könnte deren Entstehung pathophysiologische Bedeutung haben.

The major histopathological hallmarks of Alzheimer`s Disease (AD) are neuritic plaques and neurofibrillary tangles which are composed of aggregates of the β-amyloid (Aβ) peptide and hyperphosphorylated tau protein, respectively. Based on the amyloid hypothesis the accumulation and aggregation of Aβ-peptides are the cause of the pathological events leading to neurodegeneration. Transgenic mice overexpressing mutant forms of the Amyloid-Precursor-Protein (APP) are a widely used tool to study potential therapeutic approaches.
In a first project the age-dependent amyloid pathology of APP23 mice, which express human APP with the Swedish mutation, was analysed and compared with authentic human brain material from AD patients. 1-dimensional (1D) and 2D electrophoresis combined with Western-blots or mass spectrometry was applied. The mice displayed a time-dependent exponential Aβ-accumulation which is in line with the “seeded-aggregation” theory. The Aβ-patterns observed in the mouse brain extracts were strikingly different to those in the human AD brain samples. While in human brain, Aβ42 is the predominant deposited peptide, the shorter variation, Aβ40, is mainly found in brain samples of APP23 mice. Further, up to 50% of the Aβ-peptides from human brain samples were modified at the N-terminus, with Aβ-peptides starting at position 3 with a pyroglutamate (Aβ(N3pE)) being the most abundant one. These peptides could also be detected in APP23 mice, but were only a minor species.
A modified version of an extraction method which was originally developed for the extraction of peripheral amyloidosis, was for the first time successfully applied for Aβ-peptides from brain samples. By applying this method, Aβ-fibrils could be prepared in pure water, without using harsh chemicals. This was confirmed by its fibrillar structure under electron microscopy. In order to prevent cross contaminations by Aβ-peptides which possess a high aggregation propensity, during 2DE, a multi-step cleaning procedure, involving the use of proteinase K was established.
In a second project, membrane anchored BACE inhibitors, with variations in the pharmakophor, the spacer length or the lipid anchor were tested in primary neuronal cells and in cell lines. BACE is the main β-secretase, the enzymatic activity, catalysing the first cleavage step of APP for the generation of Aβ-peptides. The inhibitor which was anchored to the membrane by a dihydrocholesterol anchor via a 89 Å spacer was much more effective than the free inhibitor in reducing the concentration of Aβ-peptides. Inhibitors with lipid anchors which inserted preferentially in lipid rafts proved to be more efficient than inhibitors with non-raftophilic anchors. Additionally, the inhibitor could be further optimized, by adjusting the distance of the inhibitor to the membrane. Interestingly, the inhibitors had differentially effects on the generation of Aβ-peptides derived from APP wild-type (APPwt) and from APP with the Swedish mutation (APPsw). After BACE inhibition Aβ-peptides were generated from APPwt which differed at their N-termini and which could not be detected in cells expressing APPsw. As N-terminal modified Aβ-peptides are a predominant species in human amyloid plaques, their formation might have pathophysiological relevance

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Schieb, Heinke: Die Amyloidablagerung in einem Mausmodell der Alzheimer Demenz und die Modulation der β-Amyloid-Peptidentstehung durch membranverankerte Inhibitoren. 2011.

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