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Zellpolaritäten und Achsenentwicklung beim präimplantativen Säugerembryo : Immunhistochemische Untersuchungen am Kaninchenembryo und entwicklungsbiologische Diskussion

Littwin, Timm

Ziel dieser Arbeit war es, die von Antczak und Van Blerkom (1997 und 1999) vorgelegten Befunde über eine asymmetrische Leptinverteilung im präimplantativen Säugerembryo im Kaninchenmodel zu überprüfen und sie ggf. mit anderer Methodik kritisch zu hinterfragen. Antczak und Van Blerkom hatten publiziert, dass Leptin in Ooyzten, Zygoten, Furchungsstadien, Morulae und Blastozysten polar verteilt ist. Nicht nur enthalten innere Blastomeren weniger Leptin als äußere, sondern vor allem soll es danach im Embryo einen leptinarmen- und reichen Pol geben. Die Fragestellung steht im Kontext einer in den vergangenen etwa 15 Jahren aufgekommenen Diskussion um die Entstehung frühembryonaler Achsen, die die hierzu bisher gängige Auffassung (dass die Emb-Ab-Achse, der Vorläufer der Dorso-Ventral-Achse, nicht prädeterminiert sei sondern aufgrund stochastischer Prozesse entstehe) in Frage stellt. Die A-V-Achse der Oozyte/Zygote hat nach dieser Vorstellung kein bleibendes Korrelat, die zweite definitive Körperachse, die Kranio-Kaudal-Achse, entsteht nach dieser Ansicht erst relativ spät, im Rahmen der Gastrulation. Durch neue experimentelle Befunde verschiedener Arbeitsgruppen ist dieses konventionelle Vorstellungskonstrukt in Frage gestellt worden. Die Untersuchung von immunhistochemischen Ganzpräparaten von Kaninchenmorulae und –blastozysten im CLSM konnte eine Ungleichverteilung des Leptins zu Gunsten der äußeren Blastomeren (der präsumptiven Trophoblastzellen) bestätigen. Das zusätzliche Vorliegen eines den Embryo erfassenden Gradienten im Sinne eines leptinreichen und –armen Pols schienen auch unsere CLSM-Daten zu suggerieren; Kontrollen mit alternativer Methodik zeigen jedoch, dass es sich hierbei offenbar um ein methodisch bedingtes Artefakt handelt: Histologische Realschnitte bestätigen zwar, dass Leptin überwiegend in den äußeren Blastomeren (mit Maximum am PVS-nahen Zellpol) lokalisiert ist, dass aber eine polare Ungleichverteilung über den ganzen Embryo nicht vorliegt. Zusätzlich zeigten die Experimente an den Realschnitten aber ein Vorkommen von Leptin in den extrazellulären embryonalen Hüllen. Die Entstehungsmöglichkeiten von Artefakten in histochemischen Untersuchungen am Ganzpräparat mit dem CLSM werden methodenkritisch diskutiert. Angaben über Ungleichverteilungen innerhalb dreidimensionaler Objekte aus CLSM-Untersuchungen müssen mit großer Zurückhaltung interpretiert werden. Der bislang suggestivste publizierte Befund bezüglich präimplantativ segregierter Morphogen-Gradienten beim Säugetier ist daher kritisch zu hinterfragen. Die vorgelegten Befunde stützen die von Johnson (1981) eingeführte Polarisationshypothese, die als Mechanismus der Allokation der Blastomeren zu ICM/TB die Entwicklung einer apikobasalen Polarität in Blastomeren und die Abspaltung apolarer innerer Zellen annimmt. Hinweise auf eine Prädetermination der Achsen des Embryos lassen sich anhand der Leptinverteilung nicht herleiten.

Previous reports on segregation of certain cytoplasmic molecules during cleavage and blastocyst formation in the human and the mouse (Antczak and Van Blerkom, 1997, 1999) are reinvestigated in the rabbit model, comparing two approaches: whole-mount immunohistochemistry followed by confocal laser scanning microscopy (WM-IHC/CLSM) vs. IHC performed on histological sections of resin-embedded material (S-IHC). This study concentrates on leptin and cytoskeletal proteins (actin and cytokeratins). With S-IHC, leptin was localized predominantly on the surface of blastomeres facing the perivitelline space, and in the extracellular embryonic coats, without any polar asymmetry along embryonic axes. A polar distribution of leptin on/in the blastomeres (that could be indicative of early axis and cell type specification) was seen only with WM-IHC/CLSM, not with S-IHC, although the latter gave excellent resolution. Artifacts that can occur with the two methodological approaches are critically discussed. It is concluded that these data call for cautioning when studying distribution patterns of diffusible molecules with WM-IHC/CLSM technology. They do not argue for leptin being involved in or being indicative of early embryonic pattern formation (in the sense of segregation) during cleavage.

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Littwin, Timm: Zellpolaritäten und Achsenentwicklung beim präimplantativen Säugerembryo. Immunhistochemische Untersuchungen am Kaninchenembryo und entwicklungsbiologische Diskussion. 2008.

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