Funktionelle Analyse und Regulation des Zinkfingerproteins Gfi1 bei Lymphozyten anhand gentechnisch veränderter Mäuse
Gfi1 ist ein nukleäres Zink-Finger Protein, das als transkriptioneller Repressor agiert und wichtige Funktion in der T-Zellentwicklung, in der Granulopoese und in der angeborenen Immunantwort besitzt. Um die in vivo Regulation und Expression von Gfi1 eingehend untersuchen zu können, wurde das Gfi1 Gen in der Maus durch homologe Rekombination in embryonalen Stammzellen so verändert, dass fast die komplette kodierende Region durch das Reportergen GFP ersetzt wurde. Gleichzeitig wurde ein Teil des Gfi1 Gens so deletiert, dass sowohl der gesamte Promoterbereich, als auch das letzte Exon, das das Polyadenylierungssignal enthält, intakt blieben. Rekombination beider Gfi1 Allele führte zu einer Deletion des Gfi1 Gens. Diese Tiere zeigen denselben Phänotyp wie die publizierte Gfi1-KO Mausmutante (Karsunky et al., 2002), in der das Gfi1 Gen durch die Insertion des Neomycin Gens inaktiviert wurde. Die höchste Gfi1 Expression während der B-Zell Differenzierung im Knochenmark wurde in den frühen B-Zell-Subpopulationen gefunden. Während der T-Zellentwicklung ist die Gfi1 Expression auf ihrem höchsten Niveau in den Stadien der prä-TCR und der TCR abhängiger Differenzierungsschritte. In reifen B-Zellen findet keine Gfi1 Expression statt, allerdings ist diese nach Stimulation hochreguliert. Im Gegensatz dazu zeigen die peripheren T-Zellen eine geringe, basale Gfi1 Expression, die nach Aktivierung über den TCR stark zunimmt, um anschließend in den Gedächtniszellen wieder abzuklingen. Die konstitutive Expression von Gfi1 unter dem lck-Promoter in den Gfi1GFP/GFP-Mäusen führte zur transkriptionellen Repression des Gfi1:GFP Allels in den T-Zellen. In vivo sowie in vitro Experimente bestätigten die Hypothese, dass Gfi1 durch direkte Bindung an den eigenen Promotor, die eigene transkriptionelle Aktivität über Rückkopplungsmechanismen selbst reguliert. Mit Hilfe der publizierten Gfi1-defizienten Maus wurde die essentielle Rolle von Gfi1 während der Thymozyten-Reifung weiter untersucht. Diese Mäuse zeigen eine drastische Reduktion der Thymozytenzahl, die auf eine erhöhte Apoptoserate, Verlust der Proliferation und einen Differenzierungsblock in den sehr frühen Lin-c-Kit+ T-Vorläuferzellen zurückzuführen ist. Diese Zellen stellen die ersten zytokinabhängigen T-Vorläuferzellen dar, die noch keine V(D)J-Umgruppierung des T-Zellrezeptor b Lokus vorgenommen haben und auch noch keiner Selektion unterworfen wurden. Ein weiterer wichtiger Befund aus den Gfi1-KO Tieren ist, dass Gfi1 im Prozess der positiv/negativ Selektion von Thymozyten und der damit verbundenen CD4/CD8-Linienentscheidung eine wichtige Funktion zukommt. In den Gfi1-defizienten Thymus konnte eine Beschleunigung der MHC Klasse I restringierten positiv Selektion als auch eine prozentual vermehrte Bildung von CD8+-SP-T-Zellen festgestellt werden. Durch vergleichende DNA Mikroarray Analysen von sortierten DP und gesamt Thymozyten aus Gfi1-defizienten Tieren und WT-Kontrollen konnte gezeigt werden, dass die Expression spezifischer Gene von Gfi1 reprimiert wird. Eine deregulierte hohe Expression in den Gfi1-defizienten Zellen konnte für die Gene Id1, Id2, LKLF und TRAF5 gezeigt werden. Diese Befunde deuten auf die Existenz neuer Regulationmechanismen während der prä-T-Zellentwicklung und Selektionsprozessen hin, in denen Gfi1 eine essentielle Rolle spielt.
Preview
Cite
Citation style:
Could not load citation form.