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Dissertation angenommen durch: Universität Duisburg-Essen, Campus Duisburg, Fachbereich Chemie, 2005-06-29
BetreuerIn: Prof. Dr. Hans-Curt Flemming , Universität Duisburg-Essen, Campus Duisburg, Fachbereich Chemie, Biofilm Centre
GutachterIn: Prof. Dr. Hans-Curt Flemming , Universität Duisburg-Essen, Campus Duisburg, Fachbereich Chemie, Biofilm Centre
GutachterIn: Prof. Dr. Karl-Erich Jaeger , Heinrich-Heine Universität Düsseldorf im Forschungszentrum Juelich, Fakultät für Biologie, Institut für Molekulare Enzymtechnologie
Schlüsselwörter in Deutsch: Biofilm, Pseudomonas aeruginosa, extrazelluläre polymere Substanzen, EPS, extrazelluläre Enzyme, Biofilmstruktur, Biofilmentwicklung, Enzymaktivität
Schlüsselwörter in Englisch: biofilm, Pseudomonas aeruginosa, extracellular polymeric substances, EPS, extracellular enzymes, biofilm structure, biofilm development, enzyme activity
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Abstrakt in Deutsch
Pseudomonas aeruginosa ist ein weit verbreiteter, opportunistischer Krankheitserreger. Dieses Bakterium sekretiert eine Vielzahl an Hydrolasen, wobei einige davon als Virulenzfaktoren angesehen werden, andere eine Rolle bei der Verfügbarmachung von Nährstoffen spielen. Der mögliche Einfluss extrazellulärer Enzyme auf die Biofilmbildung und -struktur und die Eigenschaften der Biofilme und ihrer extrazellulären polymeren Substanzen (EPS) wurde bisher nicht untersucht.
In der vorliegenden Arbeit wurde der mucoide P. aeruginosa-Stamm SG81 mit Derivaten verglichen, die verschiedene extrazelluläre Hydrolasen überproduzieren. Dafür wurden die Gene der Lipasen LipA und LipC, der Esterase EstA und der Elastase LasB kloniert, unter die Kontrolle eines konstitutiven Promotors gestellt und in den Stamm SG81 eingebracht, sodass es zu einer moderaten Überexpression dieser Enzyme kam. Biofilme dieser Überexpressions-Stämme wurden unter kontinuierlichen Bedingungen in Durchflusszellen angezüchtet und die Entwicklung mit dem konfokalen Laser-Scanning Mikroskop (CLSM) verfolgt. Zudem wurde die EPS-Zusammensetzung und die physikochemischen Eigenschaften der EPS analysiert.
Während die Überexpression von lipA keine Unterschiede zum Ausgangsstamm ergab, zeigten die anderen Enzyme einen deutlichen Einfluss auf die Biofilmstruktur und/oder die Eigenschaften der EPS. Im Gegensatz zum Ausgangsstamm SG81, der nach 72 h einen heterogenen, relativ flächendeckenden, mehrlagigen Biofilm ausbildete, zeigte die LipC-Überexpression einen weniger dichten Biofilm mit einigen kleinen, aber dafür stark aggregierten und höheren Mikrokolonien. Einen Einfluss von LipC auf die EPS-Zusammensetzung konnte nicht nachgewiesen werden. Die EstA-Überproduktion bewirkte, dass sich der anfänglich normal entwickelte Biofilm nach 72 h auflöste und sich nur noch eine gleichmäßig verteilte Schicht aus Einzelzellen auf der Aufwuchsfläche beobachten ließ. Im Vergleich zu dem Ausgangsstamm zeigten die EPS des lipC-Überexpressionsstamms einen deutlich erhöhten Gesamtkohlenhydrat- und Rhamnolipidgehalt. Darüber hinaus wiesen die EPS eine erhöhte Hydrophobizität und Viskosität auf. Die Überproduktion der Elastase B bewirkte, dass sich gar kein Biofilm ausbilden konnte und nach 72 h nur vereinzelt kleine Zellaggregate zu beobachten waren, die unregelmäßig verteilt über die Aufwuchsfläche verteilt vorlagen. Zudem war die extrazelluläre Alginat-Konzentration verringert, während der Gesamtkohlenhydratgehalt erhöht war. Wie beim EstA Überproduktionsstamm wies die EPS der LasB-Überproduktion eine gesteigerte Hydrophobizität und Viskosität auf. Zusätzlich konnte ein Einfluss auf die rheologischen Eigenschaften des Biofilms nachgewiesen werden.
Mit Gfp-Enzympromotor-Fusionen konnte für die LipA eine kontinuierliche Transkription über die gesamte Biofilmentwicklung nachgewiesen werden, während die estA Expression zum einen deutlich verzögert und zum anderen nur in wenigen Zellen des Biofilms erfolgte.
Die Ergebnisse zeigen, dass die Überexpression von extrazellulären Enzymen die Zusammensetzung und Eigenschaften der EPS beeinflussen kann und darüber hinaus eine Rolle bei der Biofilmentwicklung spielen.
Abstrakt in Englisch
Pseudomonas aeruginosa is an increasingly prevalent opportunistic human pathogen. It secretes a variety of hydrolases, many of which contribute to virulence or are thought to play a role in nutrition of the bacterium. However, potential roles of these extracellular enzymes in biofilm formation or composition of the extracellular polymeric substances (EPS) have not been studied. The aim of this study was to compare biofilms of the mucoid P. aeruginosa strain SG81 and its derivatives overexpressing different extracellular hydrolases. For this the genes for lipases LipA and LipC, the esterase EstA and elastase LasB were moderately overexpressed from plasmids in strain SG81. Biofilms were grown in flow-cells, analyzed by confocal laser-scanning microscope (CLSM) and the effects on EPS composition and physicochemical properties were investigated. Whereas lipA overexpression revealed no significant differences, the other enzymes influenced biofilm structure and/or EPS properties. In contrast to the parent strain, cells overproducing LipC were more heterogeniously distributed in the biofilm which was predominently composed of microcolonies consisting of highly packed cells. However, LipC overproduction had no influence on the EPS composition. Overproduction of EstA led to differences in biofilm architecture and resulted in premature biofilm dissolution. Compared to the parent strain the EPS showed differences in the concentrations of carbohydrates and rhamnolipids. Moreover, hydrophobicity and viscosity of the EPS were significantly increased. Overproduction of LasB had the most pronounced effects on biofilms: a drastically reduced ability to form an elaborate biofilm architecture resulting in a monolayer of unevenly distributed cells even after prolonged times of growth. Furthermore, the concentration of alginate was reduced, whereas the total concentration of carbohydrates increased. Like in the EstA overproducing strain the hydrophobicity and viscosity of the EPS were increased.
With Gfp-enzympromotor-fusions it was possible to located a continuous transcription of lipA in all cells of the biofilm. In Contrast the transcription activity of the estA gene occurred only in a few cells at a later state of biofilm developement.
These results clearly indicate that overexpression of extracellular enzymes can affect EPS composition and properties, thereby influencing biofilm development. Altogether, this data provides strong evidence that extracellular enzymes, in addition to their roles in virulence and nutrition, have a key role in the differentiation of microbial biofilms.
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