Alexander Rode :

Isolierung und Charakterisierung von bakteriellen extrazellulären polymeren Substanzen aus Biofilmen

Dissertation angenommen durch: Universität Duisburg-Essen, Campus Duisburg, Fakultät für Naturwissenschaften, Institut für Grenzflächen-Biotechnologie, 2004-09-08

BetreuerIn: Prof. Dr. Hans-Curt Flemming , Universität Duisburg-Essen, Campus Duisburg, Fakultät für Naturwissenschaften, Institut für Grenzflächen-Biotechnologie

GutachterIn: Prof. Dr. Hans-Curt Flemming , Universität Duisburg-Essen, Campus Duisburg, Fakultät für Naturwissenschaften, Institut für Grenzflächen-Biotechnologie
GutachterIn: Prof. Dr. Christian Mayer , Universität Duisburg-Essen, Campus Duisburg, Fakultät für Naturwissenschaften, Institut für Chemie

Schlüsselwörter in Deutsch: EPS; Biofilm; Polysaccharide; Proteine; Pseudomonas; extrazellulär; Biopolymere
Schlüsselwörter in Englisch: eps; biofilm; polysaccharides; proteins; Pseudomonas; extracellular; biopolymers

  
   
 Klassifikation     
    Sachgruppe der DNB: 540 Chemie
  
   
 Abstrakt     
   

Abstrakt in Deutsch

Die Mikroorganismen im Biofilm werden von extrazellulären polymeren Substanzen (EPS) zusammengehalten. Die EPS sind die Schlüsselmoleküle für Struktur, Funktion und Organisation von Biofilmen. Für die quantitative Abtrennung der EPS vom Biofilm kommen chemische und/ oder physikalische Isolierungsmethoden zum Einsatz. Die Ausbeute an EPS ist abhängig von der Isolierungsmethode. In dieser Arbeit wurden vier unterschiedliche Methoden der EPS-Isolierung (Ablösung durch Rühren und Zentrifugieren, Einsatz von Kationenaustauscherharz, Extraktion mit Formaldehyd und Extraktion mit Formaldehyd und NaOH) an Reinkulturbiofilmen von Pseudomonas aeruginosa und Biofilmen aus der Abwasserbehandlung angewandt. Für die Reinkulturbiofilme war die Isolierung von EPS durch Rühren und Zentrifugieren geeignet. Bei Anwesenheit von Calcium im Nährmedium reichte das Rühren und Zentrifugieren allein nicht aus. Die Isolierung der EPS gelang mit der Kationenaustauscher-Methode. Bei den Umweltbiofilmen erwies sich die Isolierung von EPS mittels Kationenaustauscher als Methode der Wahl. Die EPS aus Reinkulturbiofilmen von P. aeruginosa und P. fluorescens bestanden nicht nur aus Polysacchariden, sondern auch aus bedeutenden Mengen an Proteinen. In den Umweltbiofilmen wurden zusätzlich zu den Polysacchariden und Proteinen auch Huminstoffe und DNA nachgewiesen. Eingehende Untersuchungen der EPS von P. aeruginosa ergaben, dass die EPS zu 70 Gew.-% aus Alginat bestehen. Das Alginat wies eine starke Heterogenität bezüglich der Ladung (acetylierte und nicht acetylierte Fraktion) und Molmasse auf. Neutrale Kohlenhydrate konnten durch Totalhydrolyse und anschließender Dünnschichtchromatographie in den EPS nicht nachgewiesen werden. Proteine machten ca. 28 Gew.-% der EPS aus. Es ist denkbar, dass es sich dabei nicht nur um Enzyme, sondern auch um Strukturproteine (z. B. Lektine) handelt. Auch Rhamnolipide (vor allem Di-Rhamnolipid) wurden in den EPS nachgewiesen (geringer Anteil von 1 Gew.-%); diese dürften für die Strukturbildung von Biofilmen eine wichtige Rolle spielen. Bei Zunahme der Dauer der Anzucht produzierte P. aeruginosa (auf die Zellen bezogen) mehr EPS (v. a. Alginat). Die Zusammensetzung der EPS war abhängig vom Nährmedium. In synthetischen Nährmedien wurden hohe Polysaccharid-Gehalte und fast keine Proteine (im Gegensatz zu Vollmedien) in den EPS nachgewiesen. Reinkulturbiofilme von P. fluorescens enthielten Kohlenhydrate (57 Gew.-%) und Proteine (28 Gew.-%) in den EPS. Es wurden Acetylgruppen (5 Gew.-%) und nach Hydrolyse durch Dünnschichtchromatographie Glucose und Galactose in den EPS nachgewiesen. Möglicherweise handelt es sich bei dem Polysaccharid von P. fluorescens um ein acetyliertes Galactoglucan. In Schlämmen aus der Abwasserbehandlung bildeten die Proteine gefolgt von den Kohlenhydraten die Hauptkomponente der EPS. Huminstoffe und in kleineren Mengen auch DNA konnten in diesen EPS nachgewiesen werden. Die EPS von natürlichen aquatischen Biofilmen enthielten große Mengen an Huminstoffen. Uronsäuren konnten in keinem Umweltbiofilm nachgewiesen werden. Dadurch spielen in diesen Biofilmen saure Polysaccharide keine Rolle bei der Stabilisierung des Biofilms durch Vernetzung der EPS über mehrwertige Kationen. Huminstoffe, Nucleinsäuren und saure Proteine könnten dafür verantwortlich sein.

Abstrakt in Englisch

Microorganisms in biofilms are kept together by extracellular polymeric substances (EPS). The EPS are key molecules for the structure, function and organization of biofilms. Chemical and / or physical isolation methods are being used for the quantitative separation of EPS from biofilms. The yield of EPS depends on the method of isolation. Four different methods of EPS isolation were used in this work (separation by stirring and centrifugation, use of a cation exchange resin, extraction with formaldehyde and extraction with formaldehyde and NaOH) on pure culture biofilms of Pseudomonas aeruginosa and biofilms from sewage treatment systems. The isolation by stirring and centrifugation was suitable for pure culture biofilms. If calcium was present in the growth medium stirring and centrifugation alone was not sufficient. The isolation of EPS was successful with the cation exchange method. The method of choice for the isolation of EPS from environmental biofilms was the cation exchange method. EPS from pure culture biofilms of P. aeruginosa and P. fluorescens did not only consist of polysaccharides, but also of significant amounts of proteins. In environmental biofilms humic substances and DNA were found in addition to polysaccharides and proteins. Detailed studies of the EPS from P. aeruginosa showed, that the EPS consisted of 70 % (w/w) of alginate. Alginate showed a clear heterogeneity in relation to charge (acetylated and non-acetylated fraction) and molar mass. Neutral carbohydrates were not found in the EPS after total hydrolysis followed by thin layer chromatography. Proteins amounted to 28 % (w/w) of the EPS. It is assumable that this not only related to enzymes, but also structural proteins (e. g. lectins). Rhamnose lipids (mainly di-rhamno lipid) were also found in the EPS (small amount of 1 % (w/w)); these molecules may also play an important role in the development of the biofilm structure. By increasing the time of biofilm cultivation P. aeruginosa produced (related to cell number) more EPS (mainly alginate). The composition of the EPS was depending on the nutrient medium. In synthetic media high amounts of polysaccharides and almost no proteins (in contrast to rich media) were detected in the EPS. EPS of pure culture biofilms of P. fluorescens contained carbohydrates (57 % (w/w)) and proteins (28 % (w/w)). Acetyl groups (5 % (w/w)) and glucose and galactose after hydrolysis and thin layer chromatography were detected in the EPS. Possibly the exopolysaccharide of P. fluorescens is an acetylated galactoglucan. In the analyzed sludges of waste water treatment proteins followed by carbohydrates made up the main components of the EPS. Humic substances and small amounts of DNA were detected in these EPS. The EPS of aquatic biofilms contained large amounts of humic substances. Uronic acids were not detected in any analyzed environmental biofilm. Therefore acidic polysaccharides in these biofilms cannot play any role in the stabilization of biofilms by cross linking the EPS with multivalent cations. Instead of that, humic substances, nucleic acids and acidic proteins could be responsible for cross linking.