Synthese von immunologischen Tarnkappen mittels Einkapselung von Enzymen unter Erhalt ihrer enzymatischen Aktivität
Gegenstand aktueller Forschungen ist die Herstellung eines Blutersatzstoffes, um Hypoxie schnell behandeln zu können. Der Fokus dieser Stoffe liegt dabei auf dem Transport von Sauerstoff zu dem hypoxischen Gewebe. Bei einer Wiederherstellung der Perfusion mit künstlichen Sauerstoffträgern werden jedoch nicht alle vaskulären Regulationsprozesse vollständig wiederhergestellt. Vor allem hämoglobinbasierte Sauerstoffträger sind in der Lage Stickstoffmonoxid auszunehmen und so eine Vasokonstriktion auszulösen. Außerdem wird in vielen Fällen die endotheliale Stickstoffmonoxidsynthase entkoppelt, welche dann Superoxid anstelle von Stickstoffmonoxid produziert. Die Folge ist eine noch stärkere Entkopplung und oxidativer Stress. Ziel dieser Arbeit war die Synthese und funktionelle Modifikation von Albumin-Enzym-Kapseln (AEC), insbesondere durch Veränderung der Kapselhülle sowie den Einsatz unterschiedlicher Enzyme zur Erweiterung potenzieller Anwendungen. Die Albuminhülle wurde gezielt funktionalisiert, um entweder Stickstoffmonoxid (NO) freizusetzen (über die Einführung von Nitrosogruppen) oder die antioxidative Kapazität durch Beladung mit trans-Resveratrol zu steigern. Zudem wurde die Wirkung verschiedener Vernetzungsreagenzien (Genipin und DMTMM) untersucht. Als Enzyme kamen Katalase und Superoxiddismutase (SOD) zum Einsatz. Es konnten erfolgreich AEC mit Katalase sowie Superoxiddismutase unter Verwendung von Genipin als auch DMTMM als Vernetzungsreagenz synthetisiert werden. Die Durchmesser der Partikel lagen zwischen 1 μm und 2 μm. Mit SOD synthetisierte AEC zeigten keine katalytische Aktivität, erst nach dem Lyophilisieren der Partikel war diese messbar. Die Lyophilisierung führte jedoch zu einer Ruptur der Kapseln. Wurde Katalase als Enzym verwendet, konnte eine Katalytische Aktivität gemessen werden, welche bei Verwendung von DMTMM ca. dreimal höher war als bei Genipin. Die Funktionaliserung des Albumins über eine Transnitrosierung mit Nitrosoglutathion zu S-Nitrosoalbumin ermöglichte eine gezielte Abspaltung von Stickstoffmonoxid durch Cysteamin. Mit Genipin vernetzte Kapseln setzten initial eine große Menge NO frei während bei DMTMM Vernetzung die freigesetzte Menge an NO linear von der eingesetzten Menge Cysteamin abhing. Die Funktionalisierung des BSA hatte außerdem eine Steigerung der enzymatischen Aktivität bei Genipin vernetzten Kapseln (um das Zehnfache) zur Folge, während bei DMTMM vernetzten Kapseln ein Aktivitätsrückgang beobachtet wurden. Es konnte durch verschiedene Assays (TBA-Assay, ABTS-Assay, SIN-1-Assay und Luciferase-Assay) gezeigt werden, dass die Kapseln in der Lage sind verschiedene reaktive Sauerstoffspezies und Radikale abzubauen, sowie Zellen vor deren Einfluss zu schützen.
Current research is focused on the production of a blood substitute to enable rapid treatment of hypoxia. These substances focus on transporting oxygen to hypoxic tissue. However, restoring perfusion with artificial oxygen carriers does not fully restore all vascular regulatory processes. Hemoglobin-based oxygen carriers in particular are capable of removing nitric oxide and thus triggering vasoconstriction. In addition, in many cases, endothelial nitric oxide synthase is decoupled, which then produces superoxide instead of nitric oxide. The result is even greater decoupling and oxidative stress. The aim of this work was the synthesis and functional modification of albumin enzyme capsules (AEC), in particular by modifying the capsule shell and using different enzymes to expand potential applications. The albumin shell was specifically functionalized to either release nitric oxide (NO) (via the introduction of nitroso groups) or to increase the antioxidant capacity by loading it with trans-resveratrol. In addition, the effect of various cross-linking reagents (genipin and DMTMM) was investigated. Catalase and superoxide dismutase (SOD) were used as enzymes. AEC with catalase and superoxide dismutase were successfully synthesized using genipin and DMTMM as cross-linking reagents. The particle diameters ranged between 1 μm and 2 μm. AEC synthesized with SOD showed no catalytic activity; this only became measurable after the particles had been lyophilized. However, lyophilization led to rupture of the capsules. When catalase was used as the enzyme, catalytic activity was measured, which was approximately three times higher when DMTMM was used than when genipin was used. The functionalization of albumin via transnitrosation with nitrosoglutathione to S-nitrosoalbumin enabled the targeted cleavage of nitric oxide by cysteamine. Capsules crosslinked with genipin initially released a large amount of NO, whereas with DMTMM crosslinking, the amount of NO released depended linearly on the amount of cysteamine used. The functionalization of BSA also resulted in an increase in enzymatic activity in genipin-crosslinked capsules (tenfold), while a decrease in activity was observed in DMTMM-crosslinked capsules. Various assays (TBA assay, ABTS assay, SIN-1 assay, and luciferase assay) showed that the capsules are capable of degrading various reactive oxygen species and radicals and protecting cells from their influence.