Summary
The development and progression of diseases such as cancer is the key to the development of personalized medicine. As a result, the demand for complex lipidomic analysis of relevant biological samples is growing. Analytical workflows are required that address various aspects, including sample collection, extraction, as well as final instrumental analysis and data evaluation. In these workflows, economic and sustainable considerations are becoming increasingly important to facilitate the later transition of methods to applications in systems biology or medicine. The emphasis is already progressively placed on automation, minimizing errors and risks for both operators and the process.
In this work, a complete workflow for sterol analysis was designed. At the beginning, a green, automated sample preparation was developed and compared with two commonly used extraction methods. The global lipidome was considered, and different influences, such as concentration and matrix differences were investigated. Extracting the entire lipidome presented a challenge due to the wide range of polarity. The most well-known and commonly used extraction protocol, developed by Bligh-Dyer, utilized chloroform, methanol, and water. This method achieved high recovery rates for polar lipids, such as glycolipids and phospholipids, and non-polar lipids, like triglycerides and sterols. Due to the difference in density, the organic phase formed beneath the aqueous phase. However, this protocol was only suitable for robotic extraction to a limited extent because of potential matrix carry over. Alternatively, the protocol of Matyash et al. (solvents were MTBE /MeOH) was often used, as it had similar recovery rates and was less harmful to humans and the environment in comparison. The combination of ethyl acetate and ethanol also offered a green extraction alternative. The MTBE, ethyl acetate/ethanol and n-hexane protocols from Hara et al. (for later sterol analysis) were automated and optimized for possible comparability. For the optimization, the required amount of solvent, the number of extraction steps, insertion depths into the vials and evaporation programs were adjusted. In addition, the extraction protocols were compared with each other for different matrices (matrix and concentration effects). The extraction protocol with ethyl acetate had the same and, in some cases, better recovery rates than the MTBE protocol for the entire lipid spectrum. Only for the non-polar lipids, the hexane protocol showed better recovery rates.
The next step was instrumental analysis. For this purpose, a two-dimensional heart-cut LC method was developed for the quantification of the cholesterol biosynthesis in cancer cells. The method was designed to overcome the challenges of large concentration differences and the associated strong ion suppression, as well as the structural similarities of the analytes, within a single approach. To reduce the ion suppression due to large concentration differences and to separate efficiently analytes with structural similarities, a suitable column was first determined through column screening, ensuring that all substances with the same m/z-ratio were baseline-separated. This was achieved by using a 30 mm and a 100 mm PFP column. As a result, the separation of cholesterol - which had a concentration at least 1000 times higher than the precursor molecules in the samples - from lathosterol was enabled via a heart-cut after gradient optimization, ensuring a very good separation for accurate quantification. The cholesterol and coeluting testis-meiosis activating sterol (T-MAS) were cut and focused on a trap column. After completing the detection of the first dimension separation, the fraction was injected on a second column for further separation. To be able to direct both LC flows into the MS and, therefore, detect all compounds, an additional 6-port valve was integrated for this purpose. To prevent detector saturation, the acquisition parameters for cholesterol were intentionally relaxed. This approach minimized ion suppression resulting from the high concentration disparity between cholesterol and its precursor molecules, thereby enhancing the sensitivity for the detection and quantification of all sterols. The method was subsequently validated, and NIST 1950 human plasma reference material was analyzed to assess its suitability. Finally, the method was applied to analyze cancer cells treated with statins at varying concentrations and over different time periods, aiming to identify changes in the cholesterol biosynthesis pathway.
The issue of the large concentration difference between cholesterol and its precursor molecules placed high demands on ionization and detection. Therefore, a comparison of ion sources was conducted to determine the most sensitive method with the highest linearity. For this project, a novel LC-TPI ion source developed by our group, was used, which was compared in terms of performance with the commercially available ESI and APCI sources. In addition to validation, adduct formation, matrix effects in the form of signal stability over a long measurement period and ion suppressions were also examined in more detail. Finally, the analysis of various sample materials (e.g., plasma, tissue, cells) demonstrated the broad applicability of the developed method across different biological matrices with all three ion sources. Adduct formation was considered first. With the ESI source, [M+H]+, [M+H-H2O]+ and [M+NH4]+ adducts were formed, whereas with APCI and TPI mainly only [M+H-H2O]+ was formed. This already showed that sensitivity was lost when only one transition was used in ESI. Due to the high matrix content, interferences and strong ion suppression occurred. To study the ion suppression, a constant flow of the internal standard (IS) cholesterol (2H7) was introduced into the ion source after the separation column, and both the IS signal and the cholesterol signal were monitored after injecting a sample. With ESI, the IS signal was strongly suppressed during cholesterol detection. In contrast, with APCI, the IS signal remained stable, while with TPI, there is a slight intensity loss. A similar trend was observed when analyzing ion source stability over a 26-hour period. The intensity of the cholesterol decreased most significantly over time with ESI, while APCI and TPI lost comparatively less intensity. During validation, the most sensitive LOD and LOQ values were obtained for APCI and TPI and for ESI the LOD values were between 10 to 333 times higher for the sterols and the linear range is significantly lower. This problem in particular reflected the lower possibility of quantification in the samples using the ESI source. 
As oxysterols are presumably involved in the development and progression of cancer and metastasis in addition to sterols, the method was extended to include both sterols and oxysterols. For this purpose, an isocratic step was inserted before the actual analysis, as the oxysterols were more polar than the sterols. This allowed around half of the oxysterols to be separated from each other. Using a further heart-cut (both heart-cuts were focused on the trap column and separated together on the 2D separation column), a separation of almost all substances (24- and 25-hydroxycholesterol coelute, same m/z-ratio) was achieved. LOD and LOQ values of 30 nmol/L were also achieved with the method for most substances, and thus sufficient sensitivity was achieved to detect oxysterols in the samples.
 
Zusammenfassung
Die Entstehung und das Fortschreiten von Krankheiten wie bei Krebserkrankungen sind der Schlüssel zur Entwicklung einer personalisierten Medizin. Daher steigt die Nachfrage nach umfassenden Lipidanalysen von biologischen relevanten Proben. Dazu werden komplexe Analysen benötigt, die alle Aspekte berücksichtigen, wie die Probennahme, die Probenextraktion sowie die abschließende instrumentelle Analyse und Datenauswertung. Dabei müssen heute wirtschaftliche als auch nachhaltige Aspekte immer stärker berücksichtigt werden. Die Automatisierung steht dabei heute stark im Vordergrund, damit Fehler reduziert werden und Expositionen durch schädliche Chemikalien verringert werden. Dies erlaubt anschließend einen einfacheren Transfer der Arbeitsabläufe und Methoden sowie eine Anwendung in der Systembiologie oder Medizin. 
Um dies für die Analytik von Sterolen zu erreichen, wurde ein umfangreicher Workflow konzipiert. Zu Beginn wurde eine grüne, automatisierte Probenaufarbeitung entwickelt, die mit zwei etablierten Extraktionsmethoden verglichen wurde. Dabei wurde neben den Sterolen auch das komplexe Lipidom unter verschiedenen Einflüssen wie Konzentrations- und Matrixunterschieden betrachtet. Die Extraktion des gesamten Lipidoms stellt eine Herausforderung aufgrund des großen Polaritätsspektrums dar. Das bekannteste und meistverwendete Extraktionsprotokoll von Bligh-Dyer erfolgt mit Chloroform, Methanol und Wasser. Dabei wurden hohe Wiederfindungsraten für polare Lipide, wie Glykolipide und Phospholipide, und für unpolare Lipide, wie Triglyceride und Sterole, erhalten. Wegen des Dichteunterschiedes befindet sich die organische Phase unterhalb der wässrigen Phase. Daher eignet sich dieses Protokoll aufgrund von Matrixverschleppung nur bedingt für die Extraktion mit einem Aufarbeitungsroboter. Alternativ wird das Protokoll von Matyash et al. (Lösungsmittel ist MTBE/ MeOH) öfters verwendet, da es ähnliche Wiederfindungsraten aufweist und im Vergleich weniger schädlich für Mensch und Umwelt ist. Ebenfalls bietet die Kombination aus Ethylacetat und Ethanol eine grüne Extraktionsalternative. Zur möglichen Vergleichbarkeit wurden das MTBE-, das Ethylacetat/ Ethanol- und das n-Hexan Protokoll von Hara et al. (für die spätere Sterolanalytik) automatisiert und optimiert. Für die Optimierung wurden die benötigte Lösungsmittelmenge, die Anzahl der Extraktionsschritte, Einstichtiefen in die Vials und Eindampfprogramme angepasst. Zusätzlich wurden die Extraktionsprotokolle untereinander bei verschiedenen Matrizes verglichen (Matrix- und Konzentrationseffekte). Das Extraktionsprotokoll mit Ethylacetat weist gleiche und teilweise bessere Wiederfindungsrate als das MTBE-Protokoll für das gesamte Lipidspektrum auf. Lediglich für die unpolaren Lipide zeigt das Hexan Protokoll bessere Winderfindungsraten auf. 
Anschließend erfolgt die Entwicklung einer analytischen Methode zur Quantifizierung der Cholesterolbiosynthese in Krebszellen. Dazu wurde eine zweidimensionale Heart-Cut LC-Methode entwickelt, die die Problematiken, wie große Konzentrations-unterschiede und damit verbundenen starken Ionensuppressionen, sowie strukturelle Ähnlichkeiten der Analyten, innerhalb einer Methode bewältigen konnte. Zu Beginn wurde über ein Säulenscreening eine geeignete Trennsäulen ermittelt, bei der alle Substanzen mit dem gleichen m/z-Verhältnis basisliniengetrennt vorliegen. Dies wurde bei der Verwendung einer 30 mm und einer 100 mm PFP-Säule erreicht. Dieses Vorgehen ermöglichte die Abtrennung des Cholesterins, das in den Proben eine 1000-fach höhere Konzentration als die Precursormoleküle aufweist. Mittels eines Heart-Cuts wurde das Cholesterol und das coeluierende T-MAS abgetrennt und auf einer Trapp-Säule gesammelt und fokussiert. Nach vollständiger Detektion der ersten Dimension wurde die Fraktion über eine zweite Trennsäule angetrennt und detektiert. Dafür wurde ein weiteres 6-Port-Valve integriert, um beide LC-Flüsse ins MS leiten zu können. Um eine Detektorüberladung zu vermeiden, wurden die Cholesterol Parameter verschlechtert, wodurch die Ionensuppressionen aufgrund des großen Konzentrationsunterschiedes möglichst geringgehalten wurden und so eine bessere Sensitivität für die Presurcormoleküle erzielt wurde. Die Methode wurde anschließend validiert und zur Überprüfung der Methodeneignung wurde Referenzmaterial analysiert. Die erhaltenen Ergebnisse befinden sich in derselben Größenordnung wie in der Literatur bereits beschrieben. Mit der Methode wurden abschließend Krebszellen analysiert, denen Statine über verschiedene Zeiträume und unterschiedliche Konzentrationen beigefügt wurden, um Unterschiede im Cholesterolbiosyntheseweg zu erzielen. 
Die hohen Cholesterinkonzentrationen stellen eine große Herausforderung für die Ionisation und Detektion dar. Um eine ausreichende Sensitivität und Linearität zu gewährleisten, erfolgte ein Vergleich dreier Ionenquellen. Hierfür wurde eine in unserer Arbeitsgruppe entwickelte LC-TPI-Ionenquelle eingesetzt, die hinsichtlich ihrer Leistungsfähigkeit mit den kommerziell erhältlichen ESI- und APCI-Quellen verglichen wurde. Neben der Validierung wurden auch die Adduktbildung, Matrixeffekte in Form von Signalstabilität über einen langen Messzeitraum und Ionensuppressionen näher untersucht und bei verschiedenen Applikationen getestet. Bei der Betrachtung der Adduktbildung der ESI-Quelle wurden sowohl [M+H]+, [M+H-H2O]+ und [M+NH4]+ Addukte erhalten, wo hingegen bei der APCI und TPI hauptsächlich nur [M+H-H2O]+ Addukte gebildet wurden. Dies zeigte bereits, dass bei der Verwendung lediglich einer Transition bei der ESI Sensitivität verloren geht. Durch den großen Matrixgehalt bei der Analyse von Sterolen traten starke Interferenzen und Ionensuppressionen auf. Für die Untersuchung der Ionensuppressionen wurde konstant der interne Standard (IS) Cholesterol (2H7) nach der Trennsäule über eine Spritzenpumpe zugeführt und das IS-Signal, sowie das des Cholesterols, betrachtet. Bei der ESI bracht das IS-Signal deutlich während der Detektion von Cholesterol ein. Bei der APCI hingegen bliebt das IS-Signal konstant und bei der TPI gab es einen kleinen Intensitätsverlust. Der gleiche Trend wurde bei der Betrachtung der Ionenquellenstabilität erhalten, wenn über 26 Stunden Proben analysiert wurden. Dabei sank die Intensität des Cholesterolsignales bei der ESI am deutlichsten über die Zeit ab, APCI und TPI verloren vergleichsweise weniger Intensität. Bei der Validierung der Methoden wurden die sensitivsten LOD und LOQ-Werte für die APCI und TPI erhalten und für die ESI lagen die LOD-Werte zwischen 10- bis 333-mal höher für die Sterole, zudem war der lineare Bereich deutlich geringer. Aufgrund der hohen Nachweisgrenzen konnten nur wenige Sterole mit der ESI-Quelle in den Krebszellenproben quantifiziert werden. 
Ergänzend zu den Sterolen sollten auch Oxysterole bei der Krebsentstehung und Metastasierung betrachtet werden, da diese ebenfalls Einflüsse darauf vorweisen können. Daher wurden die Oxysterole durch das Einfügen eines isokratischen Schrittes vor die eigentliche Analyse integriert, da die Oxysterole polarer als die Sterole sind. Rund die Hälfte der Oxysterole konnten bereits basisliniengetrennt werden. Über einen weiteren Heart-Cut (beide Heart-Cuts werden auf der Trap-Säule fokussiert und zusammen über die 2D Trennsäule getrennt) konnte eine Trennung fast aller Substanzen (24- und 25-Hydroxycholesterol koeluieren, gleiches m/z-Verhältnis) erreicht werden. Mit der Methode konnten für die meisten Substanzen LOD und LOQ-Werte von 30 nmol/L erreicht werden und damit ist die Methode sensitiv genug, um in den Proben Oxysterole nachzuweisen.