Gentherapeutika bieten ein großes Potential, die Lebenserwartung sowie die Lebensqualität von vielen Patienten weltweit zu verbessern. Zur Übertragung der Zielgene in die jeweilige Zielzelle werden vor allem virale Vektoren verwendet. Die rekombinanten adeno-assoziierten Vektoren (rAAV) zeigen auf Grund ihrer geringen Pathogenität, ihres breiten Spektrums und der langanhalten Transgenexpression die vielversprechendsten Eigenschaften solcher Gentransfers. Daher wurden auch in den letzten Jahren weltweit verschiedene AAV-basierte Gentherapeutika als Medikament zugelassen. Die kostenintensive Produktion dieser Vektoren und die begrenzte Skalierbarkeit mit aktuellen Produktionssystemen sowie die immer größer werdende Nachfrage, stellen Patienten jedoch noch häufig vor eine große finanzielle Hürde. Um dieses Problem adressieren zu können, haben wir aus einer bereits bestehenden, stabilen und induzierbaren Verpackungszelllinie ein stabiles rAAV-Produktionssystem etabliert. Dabei wurde das rAAV-Transgen gezielt in verschiedene Loci des Produktionsorganismus integriert, um zu untersuchen, inwiefern der Integrationsort einen Einfluss auf die rAAV-Produktion nimmt. Das Transfergen wurde in die hoch exprimierten Loci Aktin-Beta (ACTB), Aktin-Gamma (ACTG) und Growth Hormone 2 (GH2), den AAV wild-typ Integrationslokus AAV integration site 1 (AAVS1) sowie den nicht exprimierten Lokus G-coupled protein receptor 142 (GPR142) des CAPpack Genoms integriert. Weiterhin wurde untersucht, ob die Anzahl an Transfervektoren im Produktionsorganismus, sowie die Expressionsstärke des Transgens einen Einfluss auf den rAAV-Titer hat. Auf Poolebene konnten bei den Loci ACTB, GH2 und GPR142 signifikant erhöhte Titer ermittelt werden als bei den Pools AAVS1 und ACTG. Auf klonaler Ebene konnte ein signifikant höherer Titer für die Loci ACTB und GPR142 ermittelt werden. Eine Korrelation zwischen Kopienzahl bzw. Expressionslevel des Transgens auf die rAAV-Titer konnte jedoch nicht nachgewiesen werden. Diese Ergebnisse zeigen einen weiteren vielversprechenden Ansatz zur Optimierung zukünftiger Produktionssysteme. Zusammen mit weiteren Optimierungsstrategien kann auch dieser Ansatz helfen die Verfügbarkeit und die Qualität zukünftiger Gentherapeutika sowie die Lebensqualität der Patienten weiterhin zu verbessern.

Abstract

Gene therapies offer great potential to improve both the life expectancy and quality of life for many patients worldwide. Viral vectors are primarily used to deliver the gene of interest to the target cells. Recombinant adeno-associated vectors (rAAV) are most promising for such gene transfer due to their low pathogenicity, broad spectrum, and long-lasting transgene expression. As a result, several AAV-based gene therapies have been approved as drugs worldwide in recent years. However, the costly production of these vectors, the limited scalability of current production systems, and the increasing demand often place a significant burden on patients and healthcare systems. To address this issue, we have established a stable rAAV production system based on an existing, stable, and inducible packaging cell line. In this process, the rAAV transgene was integrated into different loci of the production cell line to investigate to what extent the integration site influences rAAV production. The transfer gene was integrated into the highly expressed loci actin-beta (ACTB), actin-gamma (ACTG), and growth hormone 2 (GH2), the AAV wild-type integration locus AAV integration site 1 (AAVS1), and the nonexpressed
locus G-coupled protein receptor 142 (GPR142) of the CAPpack genome. Additionally, it was examined whether the overall number of transfer vectors in the production organism and the expression levels of the transgene have an impact on the rAAV titer. At pool level, significantly higher titers were determined for the loci ACTB, GH2, and GPR142 compared to the pools AAVS1 and ACTG. At clonal level, a significantly higher titer for the loci ACTB and GPR142 was observed. No correlation between copy number or transgene expression levels and rAAV titers could be demonstrated. These results present another promising approach for optimizing future production systems. Along with further optimization strategies, this approach can also help improve the availability and quality of future gene therapies, thereby enhancing the quality of life for patients.