Beiträge zur simultanen Detektion verschiedener tumorspezifischer Biomarker mittels ImmunSERS- und Immungoldfärbungen unter Verwendung hochreiner Goldnanopartikel
Immunhistochemische Methoden, bei denen gefärbte Antikörper zur Lokalisierung von Biomarkern eingesetzt werden, sind in der Krebsforschung essentiell. In dieser Arbeit wurden zwei Methoden verwendet: Bei der ImmunSERS-Mikroskopie werden plasmonisch aktive Nanopartikel, die mit Raman-Reportermolekülen funktionalisiert sind, als Färbungsreagenzien eingesetzt und mittels konfokaler Raman-Mikroskopie visualisiert. Bei der Immungoldfärbung werden Nanopartikel als Färbungsreagenzien verwendet und mittels Transmissionselektronenmikroskopie visualisiert.
Im ersten Teil wurden Gold/Gold-Kern/Satelliten-Nanopartikel als ImmunSERS-Färbungsreagenzien verwendet, da diese zwischen den Partikeln sehr hohe SERS-Verstärkungsfaktoren aufweisen. Es konnte ein Reinigungsprotokoll mittels asymmetrischer Fluss-Feld-Fluss-Fraktionierung etabliert werden, welches mit guten Auflösungen und geringen Verlusten die Abtrennung der während der Synthese im Überschuss zugegebenen Satellitenpartikel ermöglicht. Dies gewährleistet hohe Färbungsqualitäten, da falsch-negative ImmunSERS-Ergebnisse durch SERS-inaktive Satellitenpartikel verhindert werden.
Im zweiten Teil wurde eine für Immungoldfärbungen geeignete Nanopartikelbibliothek aus Goldnanosphären und Goldnanostäbchen mit (Äquivalenz-)Durchmessern von 5 bis 20 nm erstellt. Hierbei konnten eine geringe Größenstandardabweichung und hohe Formausbeute realisiert werden, wobei die asymmetrische Fluss-Feld-Fluss-Fraktionierung bei Bedarf zur Reinigung genutzt wurde. Die Eignung der Partikel für Immungoldfärbungen an Tokuyasu-Zellschnitten wurde am Beispiel mitochondrialer Proteine auf SK-BR-3-Zellen nachgewiesen. Im Anschluss an eine Optimierung des Färbungsprotokolls wurde eine Machbarkeitsstudie durchgeführt, die zeigt, dass mehrere Zielproteine (ERCC1, HER2, CK und mitochondriale Proteine) simultan mittels Immun-goldfärbungen mit Goldnanosphären (8,6 nm, 12,5 nm und 22,3 nm) und Goldnanostäbchen ((17 x 7) nm) mit hoher Färbungsspezifizität lokalisiert werden können.
Im dritten Teil wurden kleine mit 4-Nitrothiophenol als Raman-Reporter funktionalisierte Goldnanostäbchen ((25 x 8) nm) für ImmunSERS-Färbungen an fixierten SK-BR-3-Zellen eingesetzt. Zunächst wurden diese Nanostäbchen zur Färbung der beiden Biomarker HER2 und PD-L1 eingesetzt, was die Verwendbarkeit kleiner Stäbchen belegt. Anschließend wurde in einer Machbarkeitsstudie gezeigt, dass mit Nanostäbchen-basierten Färbungsreagenzien HER2 auf Krebszellen selektiv in Gegenwart von Knochenmarkszellen gefärbt werden können. Damit wurde die Grundlage für die ImmunSERS-basierte Phenotypisierung von disseminierten Tumorzellen in einer Knochenmarksumgebung geschaffen.
Insgesamt wurde durch diese Arbeit ein Beitrag zur Weiterentwicklung der Immungold- und ImmunSERS-Färbungen im Hinblick auf die Qualität der kolloidalen Färbungsreagenzien und die Einsatzmöglichkeiten der Techniken zur simultanen Detektion mehrerer Zielproteine geleistet.
Immunohistochemical methods, in which labelled antibodies are used to localise proteins on cells or tissue sections, have become indispensable in cancer research. Specifically, two methods were employed in this work: In immunoSERS microscopy, plasmonically active nanoparticles functionalised with Raman reporter molecules are used as staining reagents and visualised by confocal Raman microscopy. In immunogold staining, small nanoparticles are used as staining reagents and visualised directly by transmission electron microscopy.
In the first part, gold/gold core/satellite nanoparticles were used as immunoSERS staining reagents, as they generate very high SERS enhancement factors in the gaps between the particles. A purification protocol using asymmetric flow field flow fractionation was successfully established: This method enables the separation of core/satellite particles from unbound satellite particles added in excess during synthesis with acceptable resolutions and small losses. This ensures high staining quality, as false-negative immunoSERS results due to SERS-inactive satellite particles are prevented.
In the second part, a nanoparticle library of gold nanospheres and gold nanorods with (equivalent) diameters of 5 to 20 nm suitable for immunogold staining was introduced. A low size standard deviation and a high shape yield were achieved. If required, asymmetric flow field flow fractionation was used to purify the staining reagents. The suitability of the particles for immunogold staining on Tokuyasu cell sections was demonstrated using the example of mitochondrial proteins on SK-BR-3 cells. Following a basic optimisation of the staining protocol, a feasibility study was performed showing that several target proteins (ERCC1, HER2, CK, and mitochondrial proteins) can be localised simultaneously by immunogold staining with three different sizes of gold nanospheres (8.6 nm, 12.5 nm, and 22.3 nm) and gold nanorods (17 nm x 7 nm) with high staining specificities.
In the third part, small gold nanorods ((25 x 8) nm) functionalized with the Raman reporter 4-nitro thiophenol were used for immunoSERS staining of fixed SK-BR-3 cells. First, the aforementioned nanorods were successfully used to stain HER2 and PD-L1, demonstrating the usability of small nanorods for this application. Subsequently, a feasibility study demonstrated that nanorod-based staining reagents can be used to selectively stain HER2 on cancer cells in the presence of bone marrow cells. This provides the fundament for immunoSERS-based phenotyping of disseminated tumor cells in a bone marrow environment.
Overall, this work constitutes a contribution to the advancement of immunogold and immunoSERS staining, particularly with regard to the quality of the colloidal staining reagents and possible applications of these techniques for simultaneous detection of several target proteins.