Impact of Fusion Genes and other genetic aberrations on Pediatric Acute Myeloid Leukemia
Acute myeloid leukemia (AML) is a morphologically, immunophenotypically and genetically heterogeneous disease of the hematological system. Despite the significant improvements in overall survival rates of childhood AML patients in recent decades, there is still room for improvement in terms of event-free survival of patients150. A comprehensive genetic characterization of specific patient groups and the exploration of suitable model systems promise the identification of appropriate molecules for development of novel targeted therapies, the influence of which can be assessed in future clinical studies.
In the present thesis, various genetic and cytogenetic alterations were characterized and their prognostic impact investigated in children and adolescents with newly diagnosed AML. Firstly, patients with KMT2A rearrangement (KMT2A-r) and patients with RUNX1 mutation were studied. The overall and event-free survival of patients with KMT2A-r showed a strong dependence on the KMT2A partner gene. In contrast, no influence of the most common co-occurring mutation - the KRAS mutation – was shown. The expression of CSPG4, a surface protein that was detected in 69% of pediatric AML patients with KMT2A-r, also showed no significant influence on the prognosis of the patients. Genetic characterization of this cohort showed, in addition to KRAS mutations, a lower incidence of AML-typical mutations or the mutually exclusion of KMT2A-r with other genetic aberrations. The cohort of RUNX1-mutated patients showed no prognostic impact of RUNX1 mutations on overall or event-free survival of pediatric AML patients compared to the RUNX1 wild-type group. A strong association between RUNX1 mutation and FLT3-internal tandem duplication (ITD) was demonstrated. In both analyses, KMT2A-r and RUNX1 mutations were shown to be mutually exclusive.
Secondly, WT1 mutations were studied in this thesis as the third, prognostic-relevant alteration in pediatric AML. To this end, leukemic cell lines were characterized for the expression of WT1 and its mutations. In addition, to better understand the pathogenicity of WT1 in AML, its isotype distribution pattern was investigated in primary AML blasts as well as leukemic cell lines. The characterization revealed specific genetic patterns, which, in comparison with the data of analyzed patient cohorts, can serve as a suitable model system for the in vitro investigation of functional and therapeutic questions.
Finally, the suitability and impact of ribonucleic acid (RNA)-based fusion screening using second-generation sequencing was analyzed for pediatric patients diagnosed with AML. It was shown that the method can improve initial diagnostics, particularly through the identification of cryptic and rare fusion transcripts. Furthermore, polymorphic fusion transcripts were identified in validation experiments. A significant impact on response diagnostics was also demonstrated, as a quantitative reverse transcriptase polymerase chain reaction (qRT-PCR) could be designed for rare or highly divergent fusions to monitor the course of therapy.
In summary, the results showed the identification of clinical and genetic characteristics of pediatric AML patients, the genetic characterization of leukemic cell lines and the establishment of a method for improved fusion diagnostics in AML.
Bei der akuten myeloischen Leukämie (AML) handelt es sich um eine morphologisch, immunphänotypisch und genetisch heterogene Erkrankung des hämatologischen Systems. Trotz der deutlichen Verbesserungen der Gesamtüberlebenswahrscheinlichkeiten von kindlichen AML-Patienten in den vergangenen Jahrzehnten, ist das ereignisfreie Überleben der Patienten noch immer verbesserungsbedürftig150. Eine umfassende genetische Charakterisierung spezifischer Patientengruppen und die Untersuchung geeigneter Modelsysteme verspricht die Identifizierung geeigneter Moleküle für die Entwicklung zielgerichtete Therapieoptionen, deren Einfluss in zukünftigen klinischen Studien untersucht werden kann.
In der vorliegenden Dissertation erfolgte die genetische und zytogenetische Charakterisierung bei Kindern und Jugendlichen mit neudiagnostizierter AML sowie die Untersuchung der prognostischen und klinischen Relevanz der vorliegenden Aberrationen. Zunächst wurden zwei Patientengruppen untersucht: Patienten mit struktureller KMT2A Aberration (KMT2A‑r) und Patienten mit RUNX1-Mutationen. Das Gesamt- und ereignisfreie Überleben der Patienten mit KMT2A-r zeigte eine starke Abhängigkeit von den KMT2A-Partnergenen. Ein Einfluss der am häufigsten gleichzeitig auftretenden Mutation – der KRAS-Mutation – konnte hingegen nicht bestimmt werden. Auch die Expression von CSPG4, einem Oberflächenprotein, das in 69% der KMT2A-r pädiatrischen AML-Patienten nachgewiesen wurde, zeigte keinen signifikanten Einfluss auf die Prognose der Patienten. Die genetische Charakterisierung dieser Kohorte zeigte neben KRAS-Mutationen auch ein geringeres Vorkommen von AML-typischen Mutationen oder auch den Ausschluss von KMT2A-r mit anderen genetischen Aberrationen. Die Kohorte der RUNX1-mutierten Patienten zeigte im Vergleich zur RUNX1-Wildtyp Gruppe keinen prognostischen Einfluss von RUNX1-Mutationen auf das Gesamt- oder ereignisfreie Überleben von kindlichen AML-Patienten. Ein starker Zusammenhang zwischen RUNX1-Mutation mit der FLT3-internen Tandem Duplikation (ITD) konnte nachgewiesen werden. In beiden Analysen konnte gezeigt werden, dass KMT2A-r und RUNX1 Mutationen sich gegenseitig ausschließen.
Des Weiteren wurden in dieser Dissertation WT1 Mutationen als dritte prognostisch-relevante Aberration in der kindlichen AML untersucht. Dabei wurden leukämische Zelllinien hinsichtlich ihrer WT1 Expression und Mutation charakterisiert. Um die Pathogenität von WT1 in AML besser zu verstehen wurde zusätzlich die Isotyp-Verteilung von WT1 in primären AML-Blasten und leukämischen Zelllinien untersucht. Die Charakterisierung zeigte spezifische genetische Muster, die im Vergleich mit den Daten analysierter Patientenkohorten die Wahl eines geeigneten Modelsystems für die in vitro Untersuchung funktioneller und therapeutischer Fragestellungen verbessern können.
Zuletzt erfolgte die Analyse der Eignung und des Einflusses des Ribonukleinsäure (RNA)-basiertem Fusionsscreenings mittels Sequenzierung der zweiten Generation (NGS) für pädiatrische Patienten bei AML-Diagnose. Dabei konnte gezeigt werden, dass die Methode die initiale Diagnostik insbesondere durch die Identifikation kryptischer und seltener Fusionstranskripte verbessern kann. Des Weiteren wurden bei Validierungsexperimenten polymorphische Fusionstranskripte identifiziert. Auch für die Verlaufsdiagnostik konnte ein bedeutender Einfluss nachgewiesen werden, da auch für seltene oder hochdivergente Fusionen quantitative Reverse Transkriptase Polymerase-Kettenreaktionen (qRT-PCR) zur Überwachung des Therapieverlaufs entworfen werden konnten.
Die Ergebnisse zeigten zusammenfassend die Identifizierung klinischer und genetischer Charakteristika von pädiatrischen AML-Patienten, die genetische Charakterisierung von leukämischen Zelllinien sowie die Etablierung einer Methode zur verbesserten Fusionsdiagnostik in der AML.