Synthese, Struktur und biologische Effekte von ultrakleinen Edelmetall-Nanopartikeln
Die vorliegende Arbeit präsentiert eine Vielzahl von Synthesen zur Herstellung von mono‑ und bimetallischen Edelmetall-Nanopartikeln. Im ersten Teil sollten GSH‑terminierte monometallische Gold-, Silber- und Platin-Nanopartikel sowie bimetallische Silber‑Platin‑Nanopartikel reproduzierbar hergestellt werden. Zunächst erfolgte eine detaillierte Charakterisierung des Kerns, der Ligandenhülle, der Größe und der biologischen Wirkung gegenüber prokaryotischen und eukaryotischen Zellen. Im Anschluss erfolgte eine Diazotransfer-Reaktion durch die Einführung einer Azidgruppe. Diese wurde benötigt, um eine kovalente Bindung mit Alkin-terminierten Molekülen zu knüpfen mithilfe der Kupfer-katalysierten Klickreaktion. Die funktionalisierten Nanopartikel wurden daraufhin sowohl in in-vitro- als auch in in‑vivo‑Studien untersucht. Dabei wurde die Aufnahme der Nanopartikel, die Biodistribution und die Fähigkeit, als Drug-Delivery-System eingesetzt werden zu können, überprüft.
Die Synthese aller GSH-terminierten Nanopartikel konnte reproduzierbar durchgeführt werden. Alle verwendeten Charakterisierungsmethoden, die für die Bestimmung der Größe herangezogen wurden, zeigten eine monodisperse Partikelverteilung. Die Kerndurchmesser der Nanopartikel betrugen ca. 1 – 2 nm und wurden mithilfe einer mikroskopischen Methode (HRTEM) sowie einer Beugungsmethode (SAXS) ermittelt. In Abhängigkeit von der angewandten Methode wurden hydrodynamische Durchmesser der Nanopartikel von ca. 2 nm (DCS) bis 3 – 4 nm (DOSY) ermittelt. Infolge der veränderten Dichte der Nanopartikel, welche durch die Adsorption der Liganden bedingt ist, wurde der mittels DCS ermittelte Durchmesser unterschätzt. Die mittels DOSY-Messungen ermittelte Geschwindigkeit der Bewegung der angebundenen Liganden in der Lösung erlaubt neben der Bestimmung des hydrodynamischen Durchmessers auch Aussagen über die Reinheit der Nanopartikel nach der Synthese zu treffen.
Die Charakterisierung der Kernstruktur der Nanopartikel erfolgte als nächstes, um die elektronischen Zustände der Metallatome und die Kristallinität der Nanopartikel zu überprüfen. Die monometallischen Nanopartikel wiesen mittels FFT und XRD überwiegend metallische Kristallstrukturen auf, während für die bimetallischen Silber‑Platin-Nanopartikel nur amorphe Strukturen nachgewiesen wurden. Hierbei muss jedoch beachtet werden, dass FFT an den HRTEM-Aufnahmen durchgeführt wird. Während der HRTEM-Untersuchung treffen hochenergetische Elektronen auf die Nanopartikel, die die Kristallinität beeinflussen können, sofern eine zu lange Exposition erfolgt. Nachteilig bei der XRD-Methode ist, dass aufgrund der geringen Zahl von Atomlagen bei den ultrakleinen Nanopartikeln verbreiterte Reflexe entstehen, die eine eindeutige Zuordnung der Reflexe erschweren. Der elektronische Zustand bzw. der Bindungszustand der Metalle in den Nanopartikeln wurde mithilfe von XPS analysiert. Lediglich für die Gold-Nanopartikel konnte ein reiner Oxidationszustand von (0) nachgewiesen werden. In sämtlichen silberhaltigen Proben lag Silber als Silber (+I) vor. Alle platinhaltigen Proben zeigten vorwiegend den Oxidationszustand (+II), während ein kleiner Anteil der Photoelektronen auch Pt(0) anzeigten. Die Analyse der Struktur der Nanopartikel erwies sich insgesamt als Herausforderung aufgrund der wenigen Atomlagen der Nanopartikel bei gleichzeitig extrem hoher spezifischer Oberfläche.
Als Nächstes erfolgte die Charakterisierung des Liganden der GSH-terminierten Nanopartikel mittels NMR-Spektroskopie. Hierbei konnten bei allen platinhaltigen Nanopartikeln eine Peakverbreiterung nachgewiesen werden, sodass die Zuordnung der Protonen in α- und β-Position zum Thiol, welches direkt an der Nanopartikeloberfläche angebunden wurde, nicht erfolgen konnte. Bei den monometallischen Gold- und Silber‑Nanopartikeln konnten Protonensignale gefunden werden, die den β-H zugeordnet wurden. Durch 2D-NMR und 13C-NMR konnten die Aufspaltung der Protonen und 1J- und 2J-Kopplungen mit Kohlenstoffen beobachtet werden. Es konnte festgestellt werden, dass die Liganden unterschiedliche chemische Umgebung besitzen, die auf verschiedene Kristallflächen oder auf das Vorhandensein von Nanoclustern hindeuten. Die Quantifizierung der Liganden pro Nanopartikel und die Ermittlung der molekularen Fußabdrücke der Liganden erfolgten über verschiedene Methoden und zeigten gute Übereinstimmungen untereinander. Zudem konnten Übereinstimmungen mit ultrakleinen GSH-terminierten Nanopartikeln aus der Literatur festgestellt werden.
Die monometallischen GSH-terminierten Silber-Nanopartikel zeigten während der Lagerung in Wasser über einen Zeitraum von 4 Wochen strukturelle Veränderungen. Nach der Synthese konnten autofluoreszierende Silber-Nanocluster mithilfe von UV‑Vis‑ und Fluoreszenz-Spektroskopie nachgewiesen werden. Die Autofluoreszenz verschwand nach mehreren Wochen. Dies könnte auf die Auflösung der Cluster oder auf eine Agglomeration bzw. Ostwald-Reifung mit größeren Nanopartikeln zurückzuführen sein. Eine signifikante Änderung der Partikelgröße konnte mit verschiedenen Methoden zur Partikelgrößenbestimmung (SAXS, DCS, HAADF-STEM) nicht nachgewiesen werden. Lediglich eine leicht bimodale Partikelgrößenverteilung konnte für die neu synthetisierten Silber-Nanopartikel mittels HAADF-STEM gezeigt werden. Mithilfe von NMR-Studien konnte die Ablösung des Liganden als Dehydrosulfoglutathion unter Abspaltung von H2S beobachtet werden. Die mittels XRD über einen Zeitraum von mehreren Wochen nachverfolgten strukturellen Veränderungen resultierten aus der Reaktion des Schwefels mit dem Silber-Kern der Nanopartikel. Die strukturellen Veränderungen der Silber‑Nanopartikel wirkten sich auf die zellbiologischen Untersuchungen aus. Im neu synthetisierten Zustand wiesen die monometallischen Silber-Nanopartikel eine erhöhte Toxizität gegenüber HeLa-Zellen, gram-negativen und gram-positiven Bakterien auf. Im gealterten Zustand zeigten die Nanopartikel eine deutlich geringere Toxizität, die vermutlich auf den erhöhten Sulfidanteil der Nanopartikel zurückzuführen ist. Im Gegensatz dazu wiesen die monometallischen Gold- und Platin-Nanopartikel eine deutlich höhere Langzeitstabilität als die Silber-Nanopartikel auf. Zudem konnte keine toxische Wirkung gegenüber HeLa-Zellen, gram-negativen oder gram-positiven Bakterien festgestellt werden. Dagegen konnte bei den bimetallischen Silber-Platin-Nanopartikeln abhängig vom Silbergehalt eine erhöhte Zytotoxizität gegenüber Zellen und Bakterien festgestellt werden. Die biologische Wirkung der bimetallischen Partikel blieb nach der Alterung der Nanopartikel unverändert. Die Zugabe von Platin während der Nanopartikel Synthese verhindert somit höchstwahrscheinlich die Bildung von Silbersulfid. Die physikalische Mischung aus neu synthetisierten Silber- und Platin-Nanopartikeln konnte eine stärkere Zytotoxizität hervorrufen als eine äquivalente Menge an Ag50Pt50‑GSH Nanopartikel. In Wasser konnte keine Silberionen-Freisetzung der silberhaltigen Partikel nachgewiesen werden. Die erhöhte Toxizität könnte jedoch auf eine Freisetzung Silberionen in biologischen Medien in Gegenwart von Zellen oder Bakterien hindeuten.
Die Modifikation der Nanopartikeloberfläche erfolgte über eine Diazo-Transfer-Reaktion. Eine Quantifizierung konnte für die Gold-, Silber- und Silber-Platin-Nanopartikel durchgeführt werden und zeigte eine gute Azidierungseffizienz. Bei den Platin‑Nanopartikeln konnte keine Quantifizierung erfolgen. Allerdings konnte die Azidierung mithilfe von 13C-NMR nachgewiesen werden. Im Anschluss erfolgte die Anbindung der Farbstoffe an die Oberfläche der azidierten mono- und bimetallischen Nanopartikel mittels Kupfer-katalysierter Klickreaktion. Im Vergleich zu den in der Literatur beschriebenen Verfahren konnte mit einer geringeren Farbstoffmenge eine ähnliche Anzahl an Farbstoffen an die Oberfläche der Nanopartikel angebracht werden. Signifikante Unterschiede bezüglich der Klickeffizienz zwischen den verschiedenen Nanopartikelkernen konnten nicht festgestellt werden. Zellaufnahmestudien mittels CLSM belegten, dass alle fluoreszierenden Nanopartikelsorten in HeLa-Zellen eindringen konnten. Die Silber-Nanopartikel konnten zum Teil im Zellkern nachgewiesen werden, während die übrigen Nanopartikelsorten hauptsächlich im Zytoplasma zu finden waren. Weiterhin wurden in-vivo-Studien mit AF647-terminierten Gold-Nanopartikel an Nacktmäusen, die einen Hirntumor besaßen, durchgeführt. Die fluoreszierenden Nanopartikel konnten die Blut-Hirn-Schranke überqueren und wurden mittels IVIS in allen untersuchten Hauptorganen wiedergefunden. Die Ausscheidung der Nanopartikel erfolgte hauptsächlich über die Nieren der Versuchstiere und ist vermutlich auf die geringe Größe der Nanopartikel zurückzuführen. Histologische Befunde belegten, dass die Nanopartikel das Gewebe der Nacktmäuse nicht beeinflussten. Zudem wurde die Überlebenszeit der Versuchstiere durch die Nanopartikel nicht beeinträchtigt.
Nachdem die Biokompatibilität und die Fähigkeit, die Blut-Hirn-Schranke zu überqueren, der fluoreszierenden Gold-Nanopartikel mehrmals nachgewiesen werden konnten, erfolgte die Funktionalisierung der Nanopartikel mit biologisch relevanten Molekülen. Alkin-terminierte siRNA wurden somit im nächsten Schritt an die Oberfläche der Nanopartikel angeklickt. Dabei konnten ähnliche Klickeffizienzen festgestellt werden, wie sie bei den Farbstoffmolekülen beobachtet wurden, die ein deutlich geringeres molekulares Gewicht besitzen und zudem weniger sterisch anspruchsvoll sind. Dies deutet auf eine Limitierung der möglichen Klickpositionen auf der Nanopartikeloberfläche hin. Die Ursache hierfür sind vermutlich sterische und elektrostatische Abstoßungskräfte zwischen den angebundenen Molekülen. Im Vergleich zu 13 nm großen siRNA‑terminierten Nanopartikel konnte jedoch eine ca. 20-mal höhere siRNA‑Beladung im Bezug zum Gold erreicht werden, was auf die höhere spezifische Oberfläche der ultrakleinen Nanopartikel zurückzuführen ist. Die Nanopartikel konnten bei HeLa‑eGFP‑Zellen das Protein eGFP stummschalten. Hierbei zeigte sich im Vergleich zu vorangegangenen Studien, dass die Position der Alkingruppe am sense- oder antisense-Strang keinen signifikanten Einfluss auf die Genstummschaltungseffizienz ausübt. Des Weiteren konnte eine Hemmung der Virusreplikation von HSV-2 in infizierten Vero-Zellen nachgewiesen werden. Auch die Genstummschaltung der NF-κB Dimer‑Komponenten p65 und p50 konnte bei LBS-stimulierten Makrophagen durch die Inkubation mit siRNA‑terminierten Gold-Nanopartikeln erfolgen. Aufgrund der Biokompatibilität und der guten Zellaufnahme der siRNA-terminierten Gold-Nanopartikel erweisen sich die Partikel als Alternative zu herkömmlichen zytotoxischen Transfektionsreagenzien wie Lipofectamin. Die siRNA-terminierten Gold-Nanopartikel besitzen somit ein großes Potential für den Einsatz in zukünftigen Anwendungen, beispielsweise für die Behandlung von Viruserkrankungen oder Entzündungsreaktionen.
The present work describes a variety of syntheses for the preparation of mono- and bimetallic precious metal nanoparticles. In the initial phase of the study, monometallic gold‑silver and platinum nanoparticles, as well as bimetallic silver-platinum nanoparticles, were reproducibly synthesized using GSH-terminated nanoparticles. First, a comprehensive characterization of the core, the ligand shell, the size, and the biological effect on prokaryotic and eukaryotic cells was conducted. Subsequently, a diazotransfer reaction was conducted by introducing an azide group. This was necessary to enable the formation of a covalent bond with alkyne-terminated molecules through the bioorthogonal copper‑catalyzed click reaction. Next, the functionalized nanoparticles were subjected to investigation in both in vitro and in vivo studies, with the objective of assessing their capacity for nanoparticle uptake, biodistribution, and utilization as a drug delivery system.
The synthesis of the GSH-terminated nanoparticles demonstrated reproducibility. All characterization methods employed to ascertain the particle size demonstrated a monodisperse distribution. The core diameters of the nanoparticles were found to be approximately 1 – 2 nm and were determined using a microscopic method (HRTEM) and a diffraction method (SAXS). The hydrodynamic diameters of the nanoparticles were found to range between 2 nm (DCS) and 3 – 5 nm (DOSY), contingent on the methodology employed. As a consequence of the altered nanoparticle density resulting from ligand adsorption, the diameter determined by DCS was found to be lower than the actual value. Furthermore, the speed of movement of the bound ligands in solution, as determined by DOSY measurements, allows conclusions to be drawn about the purity of the nanoparticles after synthesis in addition to providing insight into their hydrodynamic diameter.
The subsequent phase of the investigation entailed the characterization of the core structure of the nanoparticles, with the objective of verifying the electronic states of the metal atoms and the crystallinity of the nanoparticles. The monometallic nanoparticles exhibited predominantly metallic crystal structures, as evidenced by FFT and XRD analysis. In contrast, the bimetallic silver-platinum nanoparticles exhibited exclusively amorphous structures. However, it must be noted that FFT is performed on the HRTEM images. During the HRTEM examination, high-energy electrons hit the nanoparticles, which can influence the crystallinity if the exposure is too long. One disadvantage of the XRD method is that due to the small atomic layers of the ultrasmall nanoparticles, broadened reflexes occur, which makes it challenging to clearly assign the reflexes. The electronic state or bonding state of the metals present in the nanoparticles was subsequently analyzed using X-ray photoelectron spectroscopy (XPS). The gold nanoparticles exhibited a pure oxidation state of (0). Silver exist in all platinum-containing samples in its oxide form, as Ag(+I). All platinum-containing samples exhibited the predominant oxidation state of (+II), with a minor proportion of photoelectrons also detected as Pt(0). The analysis of the structure of the nanoparticles proved to be a significant challenge due to the limited number of atomic layers present in the nanoparticles, coupled with an exceptionally high surface area.
The next step was to characterize the ligand of the GSH-terminated nanoparticles using NMR spectroscopy. A peak broadening was observed in all platinum-containing nanoparticles, which precluded the assignment of protons in the α- and β-positions to the thiol that was bound directly to the nanoparticle surface. In the case of monometallic gold and silver nanoparticles, proton signals were identified which corresponded to the β-H positions. A splitting of the protons was observed by 2D- and 13C-NMR spectroscopy and assigned to the equivalent carbons. It was determined that the ligands exhibited disparate magnetic environments, suggestive of distinct crystal faces or the existence of nanoclusters. The quantification of the nanoparticles and the determination of the molecular footprints were conducted using a variety of methods and demonstrated substantial concordance with one another, as well as correlations with ultra-small GSH‑terminated nanoparticles from the existing literature.
The monometallic GSH-terminated silver nanoparticles exhibited structural alterations when stored in water for a period of four weeks. Following synthesis, the presence of autofluorescent silver nanoclusters was confirmed through the utilization of both UV-Vis and fluorescence spectroscopy. The autofluorescence was observed to dissipate over the course of several weeks. This phenomenon may be attributed to the dissolution of the clusters or to agglomeration or Ostwald ripening with larger nanoparticles. No notable alteration in particle size was discerned through the application of diverse particle sizing techniques, including SAXS, DCS, and HAADF-STEM. A slight bimodal particle size distribution was observed for the newly synthesized silver nanoparticles using HAADF-STEM. Nuclear magnetic resonance (NMR) studies revealed the detachment of the ligand, dehydrosulfoglutathione, accompanied by the cleavage of H2S. The structural alterations observed via XRD over an extended period of several weeks were attributed to the reaction of the sulfur with the silver core of the nanoparticles. The structural alterations of the silver nanoparticles had an impact on the cellular investigations. In their newly synthesized state, the monometallic silver nanoparticles exhibited increased toxicity towards HeLa cells, gram-negative and gram-positive bacteria. In the aged state, the nanoparticles exhibited markedly reduced toxicity, which is likely attributable to the presence of sulfide in the nanoparticles. In contrast, the monometallic gold and platinum nanoparticles demonstrated enhanced long-term stability in comparison to the silver nanoparticles. Furthermore, no toxic effect against HeLa cells, gram-negative bacteria, or gram-positive bacteria was observed. In contrast, bimetallic silver-platinum nanoparticles demonstrated enhanced cytotoxicity towards cells and bacteria, contingent on the silver content. The biological effect of the bimetallic particles remained unaltered following the aging of the nanoparticles. The addition of platinum during the synthesis of nanoparticles is therefore likely to prevent the formation of silver sulfide. The physical mixture of newly synthesized silver and platinum nanoparticles demonstrated a greater capacity to induce cytotoxicity than an equivalent amount of Ag50Pt50-GSH nanoparticles. The release of silver ions from the silver-containing particles was not detected in water. However, the increased toxicity could indicate the release of silver ions in biological media in the presence of cells or bacteria.
The nanoparticle surface was modified through the use of diazo transfer. Quantification was conducted for the gold, silver, and silver-platinum nanoparticles, demonstrating effective azidation efficiency. Quantification of the platinum nanoparticles was not possible; however, azidation could be detected using 13C-NMR. Subsequently, the dyes were attached to the surface of the acidified mono- and bimetallic nanoparticles via a copper-catalyzed click reaction. In comparison to the literature, a comparable number of dyes could be attached to the surface of the nanoparticles with a smaller quantity of dye. No significant differences in click efficiency were observed between the various nanoparticle cores. The use of confocal laser scanning microscopy (CLSM) revealed that all fluorescent nanoparticle types were capable of penetrating HeLa cells. Some of the silver nanoparticles were observed within the cell nucleus, while the remaining nanoparticle types were predominantly located within the cytoplasm. Moreover, in vivo studies were conducted with AF647-terminated gold nanoparticles in nude mice with brain tumors. The fluorescent nanoparticles were observed to traverse the blood-brain barrier and were identified within all major organs examined by IVIS. The excretion of the nanoparticles was primarily via the kidneys of the test animals, which is likely attributable to the small size of the nanoparticles. Histological analysis revealed that the nanoparticles did not exert any adverse effects on the tissue of the nude mice. Moreover, the survival time of the test animals was not affected by the nanoparticles.
Following the demonstration of the biocompatibility and capacity of fluorescent gold nanoparticles to traverse the blood-brain barrier on multiple occasions, the nanoparticles were subjected to functionalization with biologically pertinent molecules. Subsequently, alkyne-terminated siRNA was attached to the surface of the nanoparticles via a click reaction. Similar click efficiencies were observed in this case as with the dye molecules, which have a significantly lower molecular weight and are also less sterically demanding. This suggests that there may be a limitation in the possible click position on the nanoparticle surface. This is likely attributable to steric and electrostatic repulsive forces between the molecules attached to the nanoparticle surface. However, compared to 13 nm siRNA-terminated nanoparticles, an approximately 20-times higher siRNA loading relative to gold was achieved, which is due to the higher specific surface area of the ultrasmall nanoparticles. The nanoparticles were observed to silence the eGFP protein in HeLa‑eGFP cells. In comparison to previous studies, it was demonstrated that the position of the alkyne group on the sense or antisense strand has no significant impact on the efficacy of gene silencing. Moreover, the study demonstrated the ability to inhibit the replication of the herpes simplex virus type 2 (HSV-2) in infected Vero cells. Additionally, gene silencing of the NF-κB dimer components p65 and p50 was achieved in LBS‑primed macrophages through incubation with siRNA-terminated gold nanoparticles. The biocompatibility and favorable cellular uptake of siRNA-terminated gold nanoparticles make them a promising alternative to conventional cytotoxic transfection reagents such as lipofectamine. These nanoparticles show great potential for future applications, including the treatment of viral diseases and inflammatory reactions.