Centromere recruitment of the Chromosomal Passenger Complex : a structural and functional dissection
Kinetochore mediated amphitelic attachments (bi-orientation) of sister chromatids to microtubules emanating from opposing spindle poles are necessary for faithful chromosome segregation during mitosis to prevent genomic instability. For that reason, kinetochore-microtubule dynamics are tightly regulated by an interplay of mitotic kinases and phosphatases. During early mitosis, when attachments are established, erroneous kinetochore-microtubule attachments are resolved by a process called Error Correction. Aurora B kinase, as part of the chromosomal passenger complex (CPC), is the key player of Error Correction and facilitates bi-orientation by destabilising erroneous attachments through phosphorylation of outer kinetochore substrates. During mitosis, the CPC localises to centromeres in a histone phosphorylation dependent manner. However, recent evidence suggests a kinetochore-associated pool of the CPC. Another model proposed liquid-liquid phase separation (LLPS) as the driver CPC centromere accumulation and function. This PhD work aimed to critically evaluate the different models for CPC recruitment.
We applied our validation strategy to a functional CPC targeting module (CPC-TARG) and demonstrated that in vitro phase separation assays are an unreliable predictor of cellular localization. In vitro LLPS of the CPC and several other kinetochore proteins was effectively counteracted by the addition of unspecific co-solutes or diluted cytomimetic medium. Instead, commonly used inert, polymeric crowding agents enhanced CPC LLPS in vitro. Furthermore, we used live-cell imaging and fixed cell analysis to provide evidence that centromeres do not nucleate or promote spatially restricted CPC LLPS. In addition to assessing the role of LLPS in CPC centromere recruitment and function, we investigated the hypothesis of a kinetochore-associated pool of the CPC. To this end, we extended our reconstitution of CPC-TARG to full-length CPC and assessed its recruitment to the reconstituted kinetochore. So far, our analyses did not reveal a direct interaction of human CPC with kinetochores. Consistent with this, we did not identify localised CPC after disruption of centromere targeting pathways by several orthogonal methods. Moreover, we identified an antibody, commonly used to stain for active Aurora B at kinetochores, to recognise multiple targets within the kinetochore.
In conclusion, this work demonstrates that there is no grammar of LLPS intrinsic to protein sequences. The results of in vitro LLPS are likely the consequence of insufficient buffering of unspecific interactions and volume exclusion effects. Furthermore, our data suggest that the two centromere recruitment pathways of the CPC are sufficient to promote faithful chromosome segregation in human cells
Während der Mitose werden die zuvor duplizierten Chromosomen gleichmäßig auf die beiden Tochterzellen aufgeteilt wird. Um dies zu gewährleisten müssen die Chromosomen an Mikrotubuli, die von gegenüberliegenden Spindelpolen ausgehen, verankert werden (Bi-orientierung). Die Verankerung wird durch Multi-Proteinkomplexe am Zentromer, den sogenannten Kinetochoren, vermittelt. Insbesondere in frühen Phasen der Mitose, wenn die Kinetochor-Mikrotubuli Bindung etabliert wird, sind andere Formen der Orientierung als Bi-orientierung möglich. Diese oft fehlerhaften Verankerungen werden im Zuge des „Error Correction“ Prozesses destabilisiert und gelöst um Fehler bei der Aufteilung der Chromosomen und somit Genominstabilität zu vermeiden. Die Kinase Aurora B, als katalytische Untereinheit des „Chromosomal Passenger Complex“ (CPC), ist ein integraler Teil eines komplexen Netzwerks, das die Destabilisierung von falschen Kinetochor-Mikrotubuli Bindungen durch Phosphorylierung innerhalb des Kinetochors reguliert. Während der Mitose wir der CPC durch spezifisch Histonphosphorylierung an das Zentromer rekrutiert. Jüngste Erkenntnisse deuten jedoch darauf hin, dass neben dem Zentromer-assoziierten Pool des CPC auch ein Kinetochor-assoziierter Pool existiert. In einem alternativen Model wird der CPC durch das Prinzip der Flüssig-Flüssig-Phasentrennung (LLPS) an das Zentromer rekrutiert und übt von dort seine Funktion aus.
Das Ziel dieser Doktorarbeit war es, die molekularen Details zwischen dem CPC und Kinetochoren zu untersuchen. Darüber hinaus haben wir eine Strategie für die Validierung von in vitro LLPS Assays entwickelt.
Um unsere Validierungsstrategie zu testen haben wir ein funktionales CPC-Konstrukt (CPC-TARG) verwendet, dass, ähnlich wie der endogene CPC, ans Zentromer rekrutiert wird. Durch eine Kombination von in vitro und in vivo Experimenten konnten wir demonstrieren, dass in vitro LLPS kein verlässliches Kriterium ist, um die Lokalisation von Proteinen in Zellen vorherzusagen. Im Falle vom CPC, und bei anderen Proteinen die das Kinetochor bilden, verhindert die Addition von verdünnten Zelllysaten oder unspezifischen Co-Soluten effektiv die Entstehung zweier mikroskopisch unterschiedlicher Phasen. Im Vergleich dazu, wird LLPS durch Zugabe von inerten Polymeren als makromolekulare „Crowder“ verstärkt. Zusätzlich haben wir durch mikroskopische Analyse von lebenden und fixierten Zellen demonstriert, dass Zentromere weder räumlich begrenzte Phasentrennung des CPC fördern noch an ihrer Entstehung beteiligt sind. Neben der Evaluation von LLPS zur Rekrutierung und Funktion vom CPC am Zentromer haben wir die Existenz eines hypothetischen Kinetochor-assoziierten Pool des CPC untersucht. Zu diesem Zweck haben wir die Rekonstitution von CPC-TARG auf ein nicht-fragmentierten CPC erweitert und die Rekrutierung an einen in vitro rekonstituierten Kinetochor analysiert. Jedoch konnten wir in biochemischen Experimenten bisher keine direkte Interaktion des CPC mit dem Kinetochor nachweisen. Unsere Experimente implizieren, dass der CPC auch in vivo hautsächlich durch die phosphorylierten Histone rekrutiert wird, da wir bei fehlender Histonphosphorylierung nur noch sehr geringe CPC-Level beobachten konnten. Des Weiteren haben wir herausgefunden, dass ein Antikörper, der üblicherweise als Marker für die aktive Kinase Aurora B in Immunfluoreszenzexperimenten verwendet wird, mehrere verschiedene Epitope innerhalb des Kinetochors erkennt.
Zusammenfassend zeigt diese Arbeit, dass es keine proteinsequenzintrinsische Grammatik der Phasenseparation gibt und dass die Ergebnisse von in vitro LLPS-Experimenten wahrscheinlich auf unzureichende Pufferung unspezifischer Interaktionen und Volumenausschlusseffekten zurückzuführen ist. Zudem deuten unsere Daten darauf hin, dass Zentromer assoziierter CPC ausreichend ist um die Chromosomentrennung während der Mitose verlässlich zu regulieren.