Combined radiotherapy with doxorubicin in preclinical soft tissue sarcoma and endothelial cell models : evaluation of the variable relative biological effectifness
Summary
Multimodal approaches in cancer treatment include combinations of surgery,
chemotherapy (CTX), and radiotherapy (RT). Sarcomas are highly aggressive
mesenchymal tumours that represent a heterogenous group of rare cancers with high
genomic complexity. Sarcoma can occur throughout the body and at all ages and can
be divided into bone sarcoma and soft tissue sarcoma (STS). STS is treated according
to subtype in expert reference centres. Doxorubicin (Dox) is a first-line drug for STS
which inhibits deoxyribonucleic acid (DNA) transcription as an alkylating agent. STS
treatment with systemic CTX such as Dox targets tumour tissue but causes side effects
in normal tissues. Locoregional RT affects normal tissue around the tumour in a
manner dependent on tumour localisation.
The overall goal of cancer treatment is to kill the tumour cells while limiting damage to
normal tissue. In general, RT uses ionising radiation (IR) that can cause direct DNA
damage or indirect damage of cellular structures via generation of reactive oxygen
species (ROS). DNA damage is detected by cells, and repair can be initiated via
different pathways. If cells re-enter the cell cycle without sufficient DNA damage repair,
cell death is induced. The principle of dose fractionation relies on less-efficiently
repaired DNA damage in rapidly proliferating tumour cells relative to slowly proliferating
normal tissue cells, resulting in higher tumour cell death rates as normal tissue
recovers. Thus, the “therapeutic window” describes dose–volume constraints
balancing tumour control and toxicity to normal tissue. New therapeutic options seek
to widen the therapeutic window.
While photons (X) deliver their maximal dose in the beginning of their range, protons
(H) are characterised by an inverse depth dose profile, sparing normal tissue before
and especially behind the tumour. In general, treatment planning for proton beam
therapy (PBT) assumes 10%-higher relative biological effectiveness (RBE) of H
compared to X. In the concept of a variable RBE, several factors, including linear
energy transfer (LET), cell type, experimental endpoint, or position in the treatment
field are important, although they are not currently considered in treatment planning.
Due to rising LET at the end of the range, H induce more complex and clustered DNA
damage relative to X. Paediatric patients or patients with tumours near critical normal
tissue structures can benefit from lower normal tissue doses of H.
This thesis project addressed four overall aims: (I) Non-inferiority of combined
radiochemotherapy with H and Dox were tested in comparison to X and Dox in STS
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models. (II) The potential impact of sequence of Dox and radiation were evaluated in
neoadjuvant, adjuvant, and concurrent settings. (III) Tumour and normal tissue effects
were compared. (IV) Finally, measured effects were evaluated in a LET-dependent
manner within a proton Bragg peak (BP) curve to extract RBE values. Tumour and
normal tissue cells were irradiated with X or H at mid-spread-out Bragg peak (SOBP),
and Dox was applied 3 h before irradiation (DoxA, neoadjuvant), 3 h before irradiation
and post irradiation until the end of the experiment (DoxB, concurrent), or only postirradiation until the end of the experiment (DoxC, adjuvant).
The first contributed study (13) investigated the radiation responses of the following
three preclinical STS cell lines with different TP53 statuses: (a) HT-1080 fibrosarcoma
cells (TP53 wildtype), (b) GCT undifferentiated pleomorphic sarcoma cells (containing
two heterozygous TP53 mutations), and (c) RD embryonal rhabdomyosarcoma cells
(containing a single, homozygous TP53 mutation). Clonogenic survival, cell cycle
distribution, apoptotic cell death, proliferation, metabolic viability, morphology, and
motility were investigated. RD cells were most radiosensitive among the STS cell
panel; in addition, GCT cells showed a chemo-resistant phenotype, whereas HT-1080
cells were radioresistant but sensitive to Dox treatment. In sensitive STS cell lines,
prolonged Dox treatment was the most effective sequence. For most endpoints, the
combination of H irradiation with Dox produced similar effects compared with X
irradiation. Additive effects occurred more frequently with X than with H (13).
In the second contributed study (15), the radiation response of HMEC-1 human
microvascular endothelial cells was evaluated in the same experimental configuration
as the STS cells regarding irradiation, Dox schedule, and endpoints. The results
showed that Dox monotreatment produced minor effects on all investigated endpoints
in endothelial cells (ECs). However, in combination with irradiation, additive effects for
longer Dox schedules were found, for example regarding reduced proliferation.
Increased viability of HMEC-1 cells following X irradiation alone or in combination with
Dox point towards the onset of senescence. Cellular effects emphasised differential
processing of endothelial damage dependent on radiation quality (15).
The third contributed study (14) examined LET-dependent RBE changes in STS and
microvascular ECs in an experimental configuration with a multi-step range shifter
(MSRS). Cells were irradiated with monoenergetic BP curves to represent dose and
LET combinations encountered in a treatment field (entrance region, BP, and distal
fall-off). Following irradiation with the MSRS, the proliferation and viability of STS cells
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demonstrated a stepwise alteration mimicking an inverse proton depth dose profile.
RBE values were extracted from viability and proliferation data of fibrosarcoma and
HMEC-1 cells. The results showed an increase of RBE at the BP distal fall-off, with
proliferation being the more robust endpoint for these specific experimental conditions
(14).
In conclusion, this thesis demonstrates (I) that H irradiation at mid-SOBP in
combination with Dox treatment exhibited non-inferiority relative to X irradiation in all
STS models and that cell-line-specific effects dependent on TP53 mutational status
could be detected. Moreover, (II) the sequence of Dox treatment and irradiation
impacted the radiation response of STS and ECs, with Dox treatment pre- and postirradiation (DoxB, concurrent) being the most effective. In general, (III) H irradiation in
combination with Dox treatment exhibited non-inferiority relative to X irradiation in an
EC model, but some indications of different mechanisms of induction of endothelial
damage dependent on radiation quality were detected. Finally, (IV) increasing LET
along the BP curve enhanced the biological effectiveness of H on viability and
proliferation of STS cells in a combined biological assay, presenting two alternative
endpoints for RBE calculation relative to clonogenic survival.
In der Krebsbehandlung umfassen multimodale Therapieansätze eine Kombination
aus Operation, Chemotherapie (CTX) und Strahlentherapie (RT). Bei der heterogenen
und seltenen Gruppe der Sarkome handelt es sich um hochaggressive mesenchymale
Tumore, die eine hohe genomische Komplexität aufweisen. Unterteilt werden Sarkome
in Knochen- und Weichgewebssarkome (WGS), die überall im Körper und in allen
Altersgruppen auftreten können. Doxorubicin (Dox) ist der Goldstandard in der CTXBehandlung von WGS und hemmt als alkylierende Substanz die DNA-Transkription.
Generell zielen eingesetzte CTX und RT auf das Tumorgewebe ab. Allerdings
verursachen sowohl systemische CTX wie Dox Nebenwirkungen im Normalgewebe,
als auch lokoregionale RT, die je nach Tumorlokalisation Auswirkungen auf das
umliegende Normalgewebe haben.
Das übergeordnete Ziel der Krebsbehandlung besteht darin, die Tumorzellen
abzutöten und gleichzeitig die Schädigung des normalen Gewebes zu begrenzen. Die
in der RT eingesetzte ionisierende Strahlung verursacht direkte DNA-Schäden oder
indirekte Schädigungen durch die Bildung von reaktiven Sauerstoffspezies. Zellen
erkennen DNA-Schäden und können die Reparatur über verschiedene Wege einleiten,
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allerdings wird der Zelltod eingeleitet, falls die Zelle ohne ausreichende Reparatur der
DNA-Schäden erneut in den Zellzyklus eintritt. Das Prinzip der Dosisfraktionierung
beruht darauf, dass DNA-Schäden in schnell proliferierenden Tumorzellen im
Vergleich zu langsam proliferierenden Zellen des Normalgewebes weniger effizient
repariert werden, was zu höheren Todesraten bei Tumorzellen führt, während sich das
Normalgewebe erholen kann. Nichtsdestoweniger beschränkt Toxizität im
Normalgewebe die maximal zu applizierende Dosis. Das therapeutische Fenster
beschreibt die Grenzen zwischen Tumorkontrolle und Normalgewebstoxizität, die beim
Einsatz neuer Therapien erweitert werden sollen.
Photonen (X) geben ihre maximale Dosis nahe der Haut, also am Anfang ihrer
Reichweite, ab, während Protonen (H) ein inverses Tiefen-Dosis-Profil aufweisen und
das Normalgewebe vor und hinter dem Tumor schonen. In der Behandlungsplanung
der Protonentherapie wird ein konstanter Wert von 10 % als höhere relative
biologische Wirksamkeit (RBW) von H im Vergleich zu X eingerechnet. Allerdings
bleiben verschiedene Faktoren, die im Konzept eines variablen RBW eine Rolle
spielen, wie der lineare Energietransfer (LET), Zelltyp oder experimentelle Endpunkt,
in der Behandlungsplanung unberücksichtigt. Aufgrund des erhöhten LETs am Ende
der Reichweite von H können sie im Vergleich zu X komplexere DNA-Schäden
verursachen. Insbesondere pädiatrische Patienten oder Patienten mit Tumoren in
direkter Nähe zu kritischen Normalgewebsstrukturen können von einer niedrigen
Normalgewebsdosis der H profitieren.
In der vorliegenden Arbeit werden vier übergeordnete Ziele verfolgt: (I) Test der
Nichtunterlegenheit der kombinierten Radiochemotherapie mit H und Dox im Vergleich
zu X und Dox in verschiedenen WGS-Modellen. (II) Evaluation des Einflusses der
Sequenz von Bestrahlung und Dox in einem neoadjuvanten, adjuvanten oder
gleichzeitigen Setting. (III) Vergleich der Effekte im Tumor- und Normalgewebe. (IV)
Auswertung der gemessenen Effekte in Abhängigkeit der Änderungen des LETs
innerhalb einer Bragg-Peak(BP)-Kurve zur Kalkulation von RBW-Werten. Hierzu
wurden Tumor- und Normalgewebszellen mit X oder mit H in der Mitte des Spread-out
Bragg Peak (SOBP) bestrahlt und mit Dox drei Stunden vor der Bestrahlung (DoxA,
neoadjuvant), drei Stunden vor und nach der Bestrahlung bis zum Ende des
Experiments (DoxB, gleichzeitig) oder nur nach der Bestrahlung bis zum Ende des
Experiments (DoxC, adjuvant) behandelt.
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In der ersten Publikation wurde die Bestrahlungsantwort von drei verschiedenen
präklinischen WGS-Zelllinien mit unterschiedlichem TP53-Status untersucht: (a) HT-
1080 Fibrosarkom-Zellen (TP 53 Wildtyp), (b) GCT undifferenzierte pleomorphe
Sarkom-Zellen (zwei heterozygote TP53 Mutationen) und (c) RD embryonale
Rhabdomyosarkom-Zellen (homozygote TP53 Mutation) (13). Untersucht wurden das
klonogene Überleben, die Zellzyklusverteilung, der Zelltod durch Apoptose, die
Proliferation, die metabolische Viabilität sowie die Morphologie und die Motilität nach
Behandlung. Die RD-Zellen sind am strahlungssensibelsten unter den WGS-Zelllinien,
die GCT-Zellen zeigten einen chemoresistenten Phänotyp, während sich HT-1080
zwar als strahlungsresistent, aber empfindlich für eine Dox-Behandlung zeigten.
Generell war die verlängerte Dox-Behandlung die wirksamste Sequenz. Die
Kombination von Protonenbestrahlung mit Dox-Behandlung zeigte für die meisten
Endpunkte ähnliche Wirkungen wie die Photonenbestrahlung, wobei additive Effekte
häufiger bei X als bei H auftraten (13).
In der zweiten Publikation wurde die Bestrahlungsantwort von HMEC-1-Endothelzellen
in der gleichen Versuchsanordnung wie beim WGS-Zellpanel hinsichtlich Bestrahlung,
Dox-Sequenzen und Endpunkten untersucht (15). Eine Monobehandlung der
Endothelzellen mit Dox hatte geringe Auswirkungen auf alle untersuchten Endpunkte.
In Kombination mit Bestrahlung konnten hingegen additive Effekte für die längeren
Dox-Behandlungssequenzen nachgewiesen werden. Unter anderem deutet die
erhöhte metabolische Viabilität von HMEC-1-Zellen nach Photonenbestrahlung allein
oder in Kombination mit Dox-Behandlung auf ein Einsetzen einer Seneszenz hin. Die
zellulären Effekte insgesamt legen eine unterschiedliche Prozessierung des
Endothelschadens in Abhängigkeit von der Bestrahlungsqualität nahe (15).
In der dritten Publikation wurden LET-abhängige RBW-Änderungen bei beiden
Zelltypen in einem experimentellen Versuchsaufbau mit einem Multi-Step Range
Shifter (MSRS) untersucht (14). Dazu wurden die Zellen mit monoenergetischen BPKurven bestrahlt, um verschiedene Dosis- und LET-Kombinationen, die in einem
Behandlungsfeld auftreten können, abzudecken (Eingangsplateau, BP und distale
Kante). Die Proliferationslevel und metabolische Viabilität der WGS-Zellen zeigten
nach Bestrahlung mit dem MSRS eine stufenweise Veränderung, die ein inverses
Tiefen-Dosis-Profil der H widerspiegelt. Anschließend wurden aus den Proliferationsund Viabilitätsdaten der Fibrosarkom- und Endothelzellen RBW-Werte extrahiert, die
einen Anstieg an der distalen Kante des BP zeigten, wobei die Proliferation einen
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robusteren Endpunkt für diese spezifischen experimentellen Bedingungen darstellt
(14).
Zusammenfassend konnten die Ergebnisse, die dieser Arbeit zugrunde liegen, (I) eine
Nichtunterlegenheit der Kombinationsbehandlung mit H in der Mitte des SOBPs und
Dox im Vergleich zu X und Dox in den untersuchten WGS-Linien zeigen; ebenfalls
ließen sich zelllinienspezifische Effekte in Abhängigkeit des TP53-Mutationsstatus
nachweisen. Des Weiteren konnte eine (II) sequenzabhängige Bestrahlungsantwort in
WGS und Endothelzellen nachgewiesen werden, wobei die Dox-Behandlung vor und
nach der Bestrahlung (DoxB, gleichzeitig) am effektivsten war. Zudem konnte (III) eine
Nichtunterlegenheit der Kombinationsbehandlung mit H und Dox im Vergleich zu X
und Dox im Endothelmodell nachgewiesen werden, wobei die zellulären Effekte
insgesamt auf strahlqualitätabhängige Mechanismen der Induktion des
Endothelschadens hinweisen. Schließlich konnte gezeigt werden, dass (IV) die
biologische Wirksamkeit von H auf die Viabilität und Proliferation von WGS-Zellen mit
zunehmendem LET entlang der BP-Kurve steigt und der kombinierte biologische
Assay einen alternativen Endpunkt zur Berechnung des RBW im Vergleich zum
klonogenen Überleben darstellt.
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