Trefoil factor family peptide 1 (TFF1) as a biomarker, its possible receptors, signaling pathways and prospective application strategies in retinoblastoma therapy
Abstract
Retinoblastoma (RB) is the most common intraocular tumor in early childhood,
originating from the juvenile retina and affecting approximately 7,500 patients each
year. RB is most frequently caused by a biallelic loss of the tumor suppressor gene
RB1.
The first part of this study focuses on our latest research findings in the field of liquid
biopsy (LB) and describes the protein "trefoil factor family 1" (TFF1) as an LB
biomarker in aqueous humor (AH) for an advanced RB subtype. TFF1 is expressed in
the eye only in tumor cells of the advanced RB subtype, demonstrating the potential
diagnostic and prognostic value of TFF1. In addition, we were able to demonstrate the
benefit of TFF1 for therapy monitoring, as decreasing TFF1 levels after treatment with
chemotherapeutic agents correlated with the onset of therapeutic success. Previous
studies of our group showed that overexpression of TFF1 in RB cells leads to
upregulation of the “gastric inhibitory polypeptide receptor” (GIPR).
The second part of this study, focuses on the role of GIPR in RB where our
investigations showed that the expression of TFF1 and GIPR correlates in patient
tumors. Further functional analysis in RB cells showed a significant decrease in cell
viability, proliferation, and growth rates, with a concomitant increase in apoptosis after
stable lentiviral GIPR overexpression, which was consistent with the effects after TFF1
overexpression. Further experiments in an alternative in vivo chicken chorioallantoic
membrane (CAM) model showed that GIPR-overexpressing RB cells formed
significantly smaller tumors than the control group. Furthermore, the effect of GIPR
overexpression in RB cells could be reversed by the addition of a GIPR inhibitor. The
addition of recombinant TFF1 showed no enhanced effect on GIPR overexpressing
RB cells, suggesting that GIPR does not serve as a TFF1 receptor. Investigations into
potential GIPR upstream and downstream mediators suggest the involvement of
miR-542-5p and p53 in GIPR regulation and signal transduction.
The third part of this study introduces new and optimized inhibitors of the “CXC
chemokine receptor type 4” (CXCR4) which were tested on RB cells and compared
with previously established inhibitors. The efficiency of the inhibitors of the CXCR4
receptor was investigated in various in vitro studies and in vivo CAM assays on RB cell
lines. In particular, the more stable inhibitor #JM198 was shown to have an improved
9antagonistic effect compared to the CXCR4 inhibitor, resulting in a significantly
improved reduction in tumor cell growth in RB cells.
The fourth part of this study discusses novel drug delivery approaches using
functionalized gold nanoparticles (GNPs) which were tested for the treatment of
chemoresistant RB cells. For this purpose, GNPs were functionalized with hyaluronic
acid (HA) for increased uptake and with atrial natriuretic peptide (ANP), known for its
inhibitory effect on neoangiogenesis, and tested in various in vitro and in vivo
experiments. In addition, different application strategies were tested in an orthotopic in
vivo RB eye model of newborn rats. Treatment of chemoresistant RB cells with ANP-
HA-GNPs in ovo resulted in a significant reduction of tumor growth and angiogenesis
compared to control groups. This effect could be verified in the rat eye model, where a
non-invasive application via eye drops was also tested, which resulted in a reduction
of tumor growth in the rat eye.
Overall, this study encompasses a multifaceted approach from the establishment of
new biomarkers to the elucidation of molecular mechanisms and the development of
targeted therapies with the aim of improving the treatment of RB, preserving patients'
vision, and facilitating long-term monitoring of tumor progression.
Abstract
Das Retinoblastom (RB) ist der häufigste intraokuläre Tumor im Kindesalter, der von
der juvenilen Netzhaut ausgeht und jährlich etwa 7500 Patienten betrifft. Das RB
entsteht fast immer durch den biallelischen Verlust des Tumorsuppressorgens RB1.
Der erste Teil dieser Arbeit befasst sich mit unseren neuesten Forschungsergebnissen
auf dem Gebiet der “Liquid Biopsy“ (LB) und beschreibt das Protein "Trefoil factor
family 1" (TFF1) als LB Biomarker im Kammerwasser für einen aggressiveren RB
Subtyp. TFF1 wird im Auge nur in Tumorzellen des aggressiveren RB-Subtyps
exprimiert, was den potenziellen diagnostischen und prognostischen Wert von TFF1
verdeutlicht. Darüber hinaus konnten wir den Nutzen von TFF1 für die Überwachung
des Therapieerfolgs aufzeigen, da sinkende TFF1-Konzentrationen nach der
Behandlung mit Chemotherapeutika mit dem Therapieerfolg korrelierten.
Vorangegangene Studien unserer Arbeitsgruppe haben gezeigt, dass die
Überexpression von TFF1 in RB-Zellen zu einer Hochregulation des “gastric inhibitory
polypeptidereceptor” (GIPR) führt.
Deshalb wurde im zweiten Teil der vorliegenden Arbeit die Rolle von GIPR im RB
untersucht und gezeigt, dass die Expression von TFF1 und GIPR in Patiententumoren
korreliert. Weitere funktionelle Analysen in RB-Zellen zeigten eine signifikante
Reduktion der Zellviabilität, Proliferation und Teilungsrate bei gleichzeitiger Erhöhung
der Apoptose nach stabiler lentiviraler GIPR-Überexpression. Diese Effekte waren
denen der TFF1-Überexpression in RB-Zellen ähnlich. In weiteren Experimenten in
einem alternativen in vivo Hühner-Chorioallantois-Membran (CAM) Modell wurde
gezeigt, dass GIPR-überexprimierende RB-Zellen signifikant kleinere Tumore bildeten
als die Kontrollgruppe. Darüber hinaus konnte der Effekt der GIPR-Überexpression in
RB-Zellen durch Zugabe eines GIPR-Inhibitors umgekehrt werden. Die Zugabe von
rekombinantem TFF1 hingegen zeigte keinen verstärkten Effekt auf GIPR-
überexprimierende RB-Zellen, was darauf hindeutet, dass GIPR nicht als TFF1-
Rezeptor fungiert. Die Untersuchung von potentiellen Upstream- und Downstream-
Mediatoren von GIPR deutet darauf hin, dass miR-542-5p und p53 an der Regulation
und der Signaltransduktion des GIPR beteiligt sind.
Im dritten Teil der vorliegenden Arbeit wurden neue und optimierte Inhibitoren des
“CXC-Chemokinrezeptors Typ 4“ (CXCR4) an RB-Zellen getestet und mit bereits
etablierten Inhibitoren verglichen. Dabei wurde die Wirksamkeit der Inhibitoren des
11CXCR4-Rezeptors in verschiedenen in vitro Studien und in vivo CAM-Assays an RB-
Zelllinien untersucht. Hierbei zeigte sich, dass vor allem der stabilere Inhibitor #JM198
eine verbesserte antagonistische Wirkung auf den CXCR4-Inhibitor ausübt und
dadurch das Tumorzellwachstum in RB-Zellen stärker reduziert.
Im vierten Teil der vorliegenden Arbeit wurden neue Ansätze zum Wirkstofftransport
mittels funktionalisierter Goldnanopartikel (GNPs) zur Behandlung von
chemoresistenten RB-Zellen getestet. Dazu wurden GNPs mit Hyaluronsäure (HA) zur
besseren Aufnahme und mit atrialem natriuretischem Peptid (ANP), das für seine
hemmende Wirkung auf die Neoangiogenese bekannt ist, beschichtet und in
verschiedenen in vitro- und in vivo- Experimenten getestet. Außerdem wurden
verschiedene Applikationsstrategien in einem zuvor neu etablierten orthotopen in vivo
RB-Augenmodell neugeborener Ratten getestet. Die Behandlung von
chemoresistenten RB-Zellen mit ANP-HA-GNPs in ovo führte zu einer signifikanten
Reduktion des Tumorwachstums und der Angiogenese im Vergleich zu den
Kontrollgruppen. Dieser Effekt konnte im Augenmodell der Ratte verifiziert werden,
wobei auch eine nicht-invasive Applikationsform über Augentropfen getestet wurde,
die das Tumorwachstum im Rattenauge reduzierte.
Insgesamt zeigt diese Arbeit einen vielschichtigen Ansatz von der Etablierung neuer
Biomarker über die Aufklärung der molekularen Mechanismen bis hin zur Entwicklung
zielgerichteter Therapien mit dem letztendlichen Ziel, die Behandlung des RB zu
verbessern, das Sehvermögen der Patienten zu erhalten und die
Langzeitüberwachung der Tumorprogression zu erleichtern.