Trefoil factor family peptide 1 (TFF1) as a biomarker, its possible receptors, signaling pathways and prospective application strategies in retinoblastoma therapy
Abstract
Das Retinoblastom (RB) ist der häufigste intraokuläre Tumor im Kindesalter, der von der juvenilen Netzhaut ausgeht und jährlich etwa 7500 Patienten betrifft. Das RB entsteht fast immer durch den biallelischen Verlust des Tumorsuppressorgens RB1. Der erste Teil dieser Arbeit befasst sich mit unseren neuesten Forschungsergebnissen auf dem Gebiet der “Liquid Biopsy“ (LB) und beschreibt das Protein "Trefoil factor family 1" (TFF1) als LB Biomarker im Kammerwasser für einen aggressiveren RB Subtyp. TFF1 wird im Auge nur in Tumorzellen des aggressiveren RB-Subtyps exprimiert, was den potenziellen diagnostischen und prognostischen Wert von TFF1 verdeutlicht. Darüber hinaus konnten wir den Nutzen von TFF1 für die Überwachung des Therapieerfolgs aufzeigen, da sinkende TFF1-Konzentrationen nach der Behandlung mit Chemotherapeutika mit dem Therapieerfolg korrelierten. Vorangegangene Studien unserer Arbeitsgruppe haben gezeigt, dass die Überexpression von TFF1 in RB-Zellen zu einer Hochregulation des “gastric inhibitory polypeptidereceptor” (GIPR) führt. Deshalb wurde im zweiten Teil der vorliegenden Arbeit die Rolle von GIPR im RB untersucht und gezeigt, dass die Expression von TFF1 und GIPR in Patiententumoren korreliert. Weitere funktionelle Analysen in RB-Zellen zeigten eine signifikante Reduktion der Zellviabilität, Proliferation und Teilungsrate bei gleichzeitiger Erhöhung der Apoptose nach stabiler lentiviraler GIPR-Überexpression. Diese Effekte waren denen der TFF1-Überexpression in RB-Zellen ähnlich. In weiteren Experimenten in einem alternativen in vivo Hühner-Chorioallantois-Membran (CAM) Modell wurde gezeigt, dass GIPR-überexprimierende RB-Zellen signifikant kleinere Tumore bildeten als die Kontrollgruppe. Darüber hinaus konnte der Effekt der GIPR-Überexpression in RB-Zellen durch Zugabe eines GIPR-Inhibitors umgekehrt werden. Die Zugabe von rekombinantem TFF1 hingegen zeigte keinen verstärkten Effekt auf GIPR- überexprimierende RB-Zellen, was darauf hindeutet, dass GIPR nicht als TFF1- Rezeptor fungiert. Die Untersuchung von potentiellen Upstream- und Downstream- Mediatoren von GIPR deutet darauf hin, dass miR-542-5p und p53 an der Regulation und der Signaltransduktion des GIPR beteiligt sind. Im dritten Teil der vorliegenden Arbeit wurden neue und optimierte Inhibitoren des “CXC-Chemokinrezeptors Typ 4“ (CXCR4) an RB-Zellen getestet und mit bereits etablierten Inhibitoren verglichen. Dabei wurde die Wirksamkeit der Inhibitoren des 11CXCR4-Rezeptors in verschiedenen in vitro Studien und in vivo CAM-Assays an RB- Zelllinien untersucht. Hierbei zeigte sich, dass vor allem der stabilere Inhibitor #JM198 eine verbesserte antagonistische Wirkung auf den CXCR4-Inhibitor ausübt und dadurch das Tumorzellwachstum in RB-Zellen stärker reduziert. Im vierten Teil der vorliegenden Arbeit wurden neue Ansätze zum Wirkstofftransport mittels funktionalisierter Goldnanopartikel (GNPs) zur Behandlung von chemoresistenten RB-Zellen getestet. Dazu wurden GNPs mit Hyaluronsäure (HA) zur besseren Aufnahme und mit atrialem natriuretischem Peptid (ANP), das für seine hemmende Wirkung auf die Neoangiogenese bekannt ist, beschichtet und in verschiedenen in vitro- und in vivo- Experimenten getestet. Außerdem wurden verschiedene Applikationsstrategien in einem zuvor neu etablierten orthotopen in vivo
RB-Augenmodell neugeborener Ratten getestet. Die Behandlung von chemoresistenten RB-Zellen mit ANP-HA-GNPs in ovo führte zu einer signifikanten Reduktion des Tumorwachstums und der Angiogenese im Vergleich zu den Kontrollgruppen. Dieser Effekt konnte im Augenmodell der Ratte verifiziert werden, wobei auch eine nicht-invasive Applikationsform über Augentropfen getestet wurde, die das Tumorwachstum im Rattenauge reduzierte. Insgesamt zeigt diese Arbeit einen vielschichtigen Ansatz von der Etablierung neuer Biomarker über die Aufklärung der molekularen Mechanismen bis hin zur Entwicklung zielgerichteter Therapien mit dem letztendlichen Ziel, die Behandlung des RB zu verbessern, das Sehvermögen der Patienten zu erhalten und die Langzeitüberwachung der Tumorprogression zu erleichtern.
Abstract
Retinoblastoma (RB) is the most common intraocular tumor in early childhood, originating from the juvenile retina and affecting approximately 7,500 patients each year. RB is most frequently caused by a biallelic loss of the tumor suppressor gene
RB1. The first part of this study focuses on our latest research findings in the field of liquid biopsy (LB) and describes the protein "trefoil factor family 1" (TFF1) as an LB biomarker in aqueous humor (AH) for an advanced RB subtype. TFF1 is expressed in the eye only in tumor cells of the advanced RB subtype, demonstrating the potential diagnostic and prognostic value of TFF1. In addition, we were able to demonstrate the benefit of TFF1 for therapy monitoring, as decreasing TFF1 levels after treatment with chemotherapeutic agents correlated with the onset of therapeutic success. Previous studies of our group showed that overexpression of TFF1 in RB cells leads to upregulation of the “gastric inhibitory polypeptide receptor” (GIPR). The second part of this study, focuses on the role of GIPR in RB where our investigations showed that the expression of TFF1 and GIPR correlates in patient tumors. Further functional analysis in RB cells showed a significant decrease in cell viability, proliferation, and growth rates, with a concomitant increase in apoptosis after stable lentiviral GIPR overexpression, which was consistent with the effects after TFF1 overexpression. Further experiments in an alternative in vivo chicken chorioallantoic membrane (CAM) model showed that GIPR-overexpressing RB cells formed significantly smaller tumors than the control group. Furthermore, the effect of GIPR overexpression in RB cells could be reversed by the addition of a GIPR inhibitor. The addition of recombinant TFF1 showed no enhanced effect on GIPR overexpressing RB cells, suggesting that GIPR does not serve as a TFF1 receptor. Investigations into potential GIPR upstream and downstream mediators suggest the involvement of miR-542-5p and p53 in GIPR regulation and signal transduction. The third part of this study introduces new and optimized inhibitors of the “CXC chemokine receptor type 4” (CXCR4) which were tested on RB cells and compared with previously established inhibitors. The efficiency of the inhibitors of the CXCR4 receptor was investigated in various in vitro studies and in vivo CAM assays on RB cell lines. In particular, the more stable inhibitor #JM198 was shown to have an improved 9antagonistic effect compared to the CXCR4 inhibitor, resulting in a significantly improved reduction in tumor cell growth in RB cells. The fourth part of this study discusses novel drug delivery approaches using functionalized gold nanoparticles (GNPs) which were tested for the treatment of chemoresistant RB cells. For this purpose, GNPs were functionalized with hyaluronic acid (HA) for increased uptake and with atrial natriuretic peptide (ANP), known for its inhibitory effect on neoangiogenesis, and tested in various in vitro and in vivo
experiments. In addition, different application strategies were tested in an orthotopic in
vivo RB eye model of newborn rats. Treatment of chemoresistant RB cells with ANP- HA-GNPs in ovo resulted in a significant reduction of tumor growth and angiogenesis compared to control groups. This effect could be verified in the rat eye model, where a non-invasive application via eye drops was also tested, which resulted in a reduction of tumor growth in the rat eye. Overall, this study encompasses a multifaceted approach from the establishment of new biomarkers to the elucidation of molecular mechanisms and the development of targeted therapies with the aim of improving the treatment of RB, preserving patients' vision, and facilitating long-term monitoring of tumor progression.