Die vorliegende Arbeit befasst sich mit der präklinischen Testung der therapeutischen Wirksamkeit des Helicobacter pylori Proteins vakuolisierendes Zytotoxin A (VacA) in der Behandlung von allergischen Atemwegserkrankungen. Die Ergebnisse sind in folgenden Veröffentlichungen erschienen:

• Treatment with Helicobacter pylori-derived VacA attenuates allergic airway disease.
Reuter S, Raspe J, Uebner H, Contoyannis A, Pastille E, Westendorf AM, Caso GC, Cover TL, Müller A and Taube C
Front. Immunol. 14:1092801. doi: 10.3389/fimmu.2023.1092801 (2023)

• Therapeutic properties of Helicobacter pylori-derived vacuolating cytotoxin A in an animal model of chronic allergic airway disease.
Raspe J, Schmitz MS, Barbet K, Caso GC, Cover TL, Müller A, Taube C and Reuter S
Respir Res 24, 178. doi: 10.1186/s12931-023-02484-5 (2023)

In Vorarbeiten konnte gezeigt werden, dass neonatale Infektionen mit Helicobcter pylori (H. pylori) im späteren Leben die Entwicklung von Asthma supprimieren können. Mittels spezifischer Depletionsmutanten konnte zudem demonstriert werden, das unter anderem das Protein VacA eine zentrale Rolle für die vorteilhaften Effekte des Bakteriums hat. In weiteren prophylaktischen Modellen konnte aufgezeigt werden, dass vergleichbar zur Infektion mit H. Pylori, auch eine Behandlung kurz nach der Geburt mit bakteriellem Extrakt sowie mit VacA die Entstehung einer allergischen Atemwegserkrankung im späteren Leben abmildern kann.
Ziel der Arbeiten der vorliegenden Doktorarbeit war es aufzuzeigen, dass sich VacA nicht nur prophylaktisch, sondern auch therapeutisch zur Behandlung von Asthma einsetzen lässt. In unterschiedlichen experimentellen präklinischen Ansätzen soll hierbei die Eignung des Moleküls, als potentielles neues Therapeutikum eruiert werden, das zukünftig bestehende Therapieformen für Asthma ergänzen oder sogar ablösen könnte. In den Studien wurde mit Hilfe von drei unterschiedlichen murinen Modellen der allergischen Atemwegserkrankung und murinen/humanen in vitro Zellkulturen die therapeutische Effizienz von VacA untersucht, der zugrundeliegende Wirkmechanismus analysiert und erste Rückschlüsse über dessen Wirksamkeit im Menschen gewonnen. Dafür wurde ein akutes, ein therapeutisches und ein chronisches Modell der Lungenerkrankung etabliert, mit deren Hilfe die Wirkung von VacA in adulten Tieren auf die Entstehung, die Therapie und den chronischen Verlauf der Erkrankung untersucht werden konnte. Ausgangspunkt der Studien war das akute Modell, in dem Tiere über die Atemwege mit den humanrelevanten Allergenen der Haustaubmilbe (HDM) sensibilisiert und anschließend durch wiederholte inhalative Allergenprovokation die allergische Atemwegserkrankung induziert wurden.
Basierend aus Erfahrungswerten der Vorarbeiten wurden Tiere zunächst intraperitoneal (i.p.) während der Provokationsphase mit VacA behandelt und anschließend der Asthma- und Immunphänotyp untersucht.
Die Behandlung mit VacA führte zu einer deutlichen Reduktion klassischer Charakteristika einer asthmatischen Atemwegserkrankung. Atemwegsüberempfindlichkeit nach Metacholinprovokation, Gesamtzellzahl von Entzündungszellen (Lymphozyten, Neutrophile und Eosinophile) in der bronchoalveolären Lavage (BAL), Ausprägung von Entzündungsreaktionen in der Lunge sowie Anzahl von Mukus-sekretierenden Becherzellen in den Atemwegen waren nach Gabe von VacA deutlich schwächer ausgeprägt. Im Vergleich zu unbehandelten Tieren konnte außerdem ein Shift der HDM-spezifischen Immunglobuline (Ig) vom Typ IgG1 hin zum Typ IgG2b beobachtet werden.
Der abgeschwächte Asthmaphänotyp, war von einer generell verminderten Immunreaktion begleitet. So konnte in VacA behandelten Tieren eine geringere Anzahl von Immunzellen (dendritischen Zellen (DC), B Zellen und T Zellen) im drainierenden Lymphknoten, ein geringerer Aktivierungsgrad der DC und eine Induktion von regulatorischen T Zellen (Tregs) am VacA Applikationsort, dem mesenterialen Lymphknoten und der Milz, detektiert werden.
Um zu untersuchen, ob VacA auch über Applikationsrouten wirksam ist, die bei potentiellen Patienten eine höhere Akzeptanz aufweisen, wurde die Behandlung auch über die inhalative und orale Route im akuten Modell durchgeführt.
Vergleichbar zur i.p. Behandlung konnte auch durch die alternativen Verabreichungsarten erfolgreich die asthmatische Reaktion abgemildert werden. Interessanterweise, konnte wieder eine Induktion von Tregs am Applikationsort des VacA beobachtet werden. Diesmal im Fall der peroralen (p.o.) Gabe in den mesenterialen Lymphknoten und nach der intratrachealen (i.t.) Applikation in der Lunge. Um zu untersuchen, ob die Induktion von Tregs auch ein Wirkmechanismus der VacA vermittelten Immunsuppression darstellen könnte wurde das akute Modell mit DEREG Mäusen erneut durchgeführt. Depletiert man Tregs während der Behandlung mit VacA in diesem transgenen Mausstamm durch die Gabe von Diphterie Toxin ist der protektive Mechanismus nicht mehr nachweisbar. Die gewonnenen Daten zeigten, dass VacA neben der prophylaktischen Gabe kurz nach Geburt auch zur Behandlung von adulten Tieren eingesetzt werden kann, um die Ausbildung einer allergischen Atemwegserkrankung zu unterdrücken. VacA kann zur Therapie über unterschiedliche Applikationsrouten eingesetzt werden und wirkt wahrscheinlich hauptsächlich über eine Modifikation der DC und Induktion von Tregs. Um zu überprüfen, ob VacA auch wirksam ist, wenn sich die allergische Atemwegserkrankung bereits vollständig etabliert hat, wurde ein therapeutisches Modell der Lungenerkrankung durchgeführt. Bei diesem Modell werden Tiere wie auch im akuten Modell mit HDM sensibilisiert und provoziert, um eine allergische Atemwegserkrankung zu induzieren. An diese schließt sich eine 6-wöchige Erholungsphase an, nach der die Tiere erneut mit dem Allergen provoziert werden und sich so die Erkrankung, vergleichbar zum Asthmatiker, rezidivierend neu ausbildet. Auch in diesem therapeutischen Ansatz, führt die Behandlung mit VacA während der sogenannten sekundären Provokation zu einem abgemilderten Asthmaphänotyp der wieder von einer Induktion von Tregs begleitet war. Asthma ist eine chronische Erkrankung der Atemwege, die die Patienten oft ein Leben lang begleitet und neben wiederkehrenden Entzündungsreaktionen auch durch Umstrukturierungsprozesse in den Atemwegen gekennzeichnet ist. Um zu analysieren, ob VacA auch im chronischen Verlauf der Lungenerkrankung wirksam ist und sich durch wiederholte Behandlungen keine Nebenwirkungen aufzeigen wurde ein chronisches Asthmamodell inklusive zwei unterschiedlicher VacA Behandlungsstrategien durchgeführt.
Hierzu wurde wie bereits beschrieben eine allergische Atemwegserkrankung in Tieren induziert, diese dann aber anschließend über einen Zeitraum von 6 Wochen zweimal wöchentlich mit dem Allergen intratracheal provoziert.
Während der langzeit-Provokation wurde ein Teil der Tiere ausschließlich am Ende der Provokationsphase mit VacA behandelt ein anderer Teil erhielt zudem eine zusätzliche Behandlung während der Hälfe der Provokationsphase. Vergleichbar zum akuten und therapeutischen Modell konnte nach beiden Behandlungsstrategien ein abgemilderter Asthmaphänotyp beobachtet werden.
Neben einer allgemein schwächeren Entzündungsreaktion in Lunge und Atemwegen konnte auch eine verminderte Atemwegsumstrukturierung in VacA behandelten Tieren beobachtet werden. Interessanterweise war die Kurzzeit-VacA-Behandlung, am Ende der Provokationsphase, mit einer Induktion von Tregs und reduzierten DC Aktivierung assoziiert. Wohingegen die Langzeittherapie mit VacA (während und am Ende der Provokationsphase) zu einer verminderten Ausbildung von CD4+ und CD8+ T Gedächtniszellen in der Lunge führte.
Um den Wirkmechanismus von VacA weiter aufzuklären und zu analysieren, ob das Molekül auch im Menschen wirksam sein könnte wurde sein Einfluss auf murine und humane DC in vitro untersucht. Sowohl bei murinen als auch bei humanen DC führte die VacA Behandlung zu einer Aktivierung der Zellen die sich durch eine stärkere Expression der proinflammatorischen Oberflächenmarker CD80 CD40 und CD86 zeigte. Im humanen Modell konnte allerdings gezeigt werden, dass neben den proinflammatorischen Proteine auch die Expression von antiinflammatorischen Rezeptoren wie PD-L1 PD-1 und ILT-3 erhöht war. Auf Zytokinebene konnte in beiden Modellen gezeigt werden, dass auch das antiinflammatorische Zytokin Interleukin (IL)-10 verstärkt im Überstand der mit VacA behandelten Zellen nachweißbar war. Spannenderweise führte die Kultur von VacA behandelten DC mit autologen T Zellen zu einer Induktion von Tregs. Die Ergebnisse zeigten, dass VacA vergleichbar auf murine und humane DC wirkt und bestätigen, dass das Molekül auch im Menschen, über eine Modulation von DC und Induktion von Tregs immunologisch wirksam sein könnte. Um zu untersuchen, ob VacA auch in vivo einen antiinflmamatorischen DC Phänotyp induziert, wurde Mäusen VacA i.p. appliziert und 24 bzw. 48 Stunden später die Expression der antiinflammatorischen Rezeptoren betrachtet. Hierbei konnte ein Anstieg von PD-L1 auf DC in der Lunge und der Milz nach 24h nachgewiesen werden. Dieser Effekt war auch noch nach 48 Stunden in der Milz nachweisbar. Zusammengefasst zeigen die Daten der präklinischen Analysen von beiden Publikationen, dass sich VacA nicht nur prophylaktisch, sondern auch therapeutisch zur Behandlung von allergischen Atemwegserkrankungen eignet. VacA hat hier nicht nur eine positive Wirkung auf die Suppression der akuten Entzündungsreaktion, sondern kann auch die Ausbildung von Umstrukturierungsprozessen, wie der Entstehung von Mukus-produzierenden Becherzellen oder subepithelialer Kollagenablagerungen entgegenwirken. Die antiinflammatorische Wirkung wird über eine Modulation der DC Antwort und Induktion von Tregs vermittelt. Da sich diese antiinflammatorische Wirkung auch in vitro bei humanen Zellen beobachten lässt, ist davon auszugehen, dass das Molekül nicht nur in Mäusen, sondern auch im Menschen wirksam sein könnte. Die Analyse zu den unterschiedlichen Applikationsrouten verdeutlicht, das VacA neben einer Injektion auch oral z.B. als Tablette oder inhalativ per Inhalator wirksam eingenommen werden könnte. In allen experimentellen Abläufen konnte in den durchgeführten Analysen keine negativen Nebenwirkungen beobachtet werden. Die Ergebnisse unterstreichen die Eignung des bakteriellen Proteins als potentielles neues Therapeutikum. Dieses könnte zukünftig als Ergänzung zu bestehenden Therapieoptionen für Asthma eingesetzt werden oder diese vollständig ersetzen. Es ist auch vorstellbar, dass der immunregulative Mechanismus von VacA nicht nur für Asthma, sondern auch für andere Krankheitsbilder mit überschießenden Immunreaktionen von Vorteil ist.
Weitere Optimierung der Formulierungen und präklinische Studien zur Wirksamkeit und Zytotoxizität werden die nächsten Schritte darstellen, hin zu klinischen Studien, die die Eignung des Therapeutikum VacA im Menschen aufzeigen werden.


This work focuses on the preclinical testing of the therapeutic effectiveness of the Helicobacter pylori protein vacuolating cytotoxin A (VacA) in the treatment of allergic respiratory diseases. The results have been published in the following publications:

• Treatment with Helicobacter pylori-derived VacA attenuates allergic airway disease.
Reuter S, Raspe J, Uebner H, Contoyannis A, Pastille E, Westendorf AM, Caso GC, Cover TL, Müller A and Taube C
Front. Immunol. 14:1092801. doi: 10.3389/fimmu.2023.1092801 (2023)

• Therapeutic properties of Helicobacter pylori-derived vacuolating cytotoxin A in an animal model of chronic allergic airway disease.
Raspe J, Schmitz MS, Barbet K, Caso GC, Cover TL, Müller A, Taube C and Reuter S
Respir Res 24, 178. doi: 10.1186/s12931-023-02484-5 (2023)

Previous studies have shown that neonatal infections with Helicobacter pylori (H. pylori) can suppress the development of asthma later in life. Specific depletion mutants demonstrated that the VacA protein plays a central role in the bacterium’s beneficial effects. In additional prophylactic models, it was shown that, similar to H. pylori infection, treatment shortly after birth with bacterial extract and VacA can mitigate the development of allergic respiratory diseases later in life.
The goal of this doctoral work was to demonstrate that VacA could be used not only prophylactically but also therapeutically for the treatment of asthma. Various preclinical experimental approaches were employed to assess the suitability of VacA as a potential new therapeutic agent that could complement or even replace existing asthma treatments.
In these studies, the therapeutic efficacy of VacA was examined using three different murine models of allergic respiratory disease and murine/human in vitro cell cultures. The underlying mechanism of action was analyzed, and initial conclusions regarding its effectiveness in humans were drawn. The studies began with an acute model in which animals were sensitized to house dust mite (HDM) allergens through the respiratory tract, followed by the induction of allergic airway disease through repeated inhalative allergen provocations.
Based on previous experience, animals were initially treated intraperitoneally (i.p.) with VacA during the provocation phase, and then the asthma and immune phenotype were examined. Treatment with VacA resulted in a significant reduction in classic characteristics of asthmatic airway disease, including airway hyperresponsiveness after methacholine provocation, total cell count of inflammatory cells (lymphocytes, neutrophils, and eosinophils) in bronchoalveolar lavage (BAL), lung inflammation, and the number of mucus-secreting goblet cells in the airways. Additionally, a shift from HDM-specific IgG1 to IgG2b immunoglobulins (Ig) was observed in VacA-treated animals compared to untreated animals.
The attenuated asthma phenotype was accompanied by a generally reduced immune response. VacA-treated animals exhibited a lower number of immune cells (dendritic cells (DC), B cells, and T cells) in the draining lymph nodes, decreased DC activation, and the induction of regulatory T cells (Tregs) at the site of VacA application, including the mesenteric lymph nodes, and the spleen.
To investigate whether VacA is effective through routes of administration that may be more acceptable to potential patients, treatment was also administered intratracheally (i.t.) and orally (p.o.) in the acute model. Similar to intraperitoneal treatment, alternative administration methods successfully mitigated the asthmatic response. Interestingly, the induction of Tregs was observed at the site of VacA application in both the case of p.o. administration in the mesenteric lymph nodes and after i.t. application in the lungs.
To examine whether the induction of Tregs could represent a mechanism of VacA-mediated immunosuppression, the acute model was repeated using DEREG mice. Depleting Tregs during VacA treatment in this transgenic mouse strain with diphtheria toxin eliminated the protective mechanism.
The obtained data showed, that in addition to prophylactic administration shortly after birth, VacA could also be used to treat adult animals to suppress the development of allergic respiratory diseases. VacA can be applied through different routes of administration and likely exerts its effects primarily through the modification of DCs and the induction of Tregs.To determine whether VacA is effective when allergic respiratory disease has already been fully established, a therapeutic model of lung disease was conducted. In this model, animals were sensitized and provoked with HDM to induce allergic respiratory disease, similar to the acute model. This was followed by a 6-week recovery phase, during which the animals were again provoked with the allergen, leading to recurrent disease development, similar to asthma in humans.
In this therapeutic approach, treatment with VacA during the so-called secondary provocation resulted in a mitigated asthma phenotype, accompanied by the induction of Tregs. Asthma is a chronic respiratory disease that often persists throughout patients’ lives, characterized by recurrent inflammatory reactions and structural changes in the airways. To analyze whether VacA is effective in the chronic course of lung disease and whether repeated treatments have any side effects, a chronic asthma model was conducted, involving two different VacA treatment strategies. In this model, as previously described, allergic respiratory disease was induced in animals, but they were then provoked with the allergen intratracheally twice a week over a 6-week period. During the long-term provocation, one group of animals was treated with VacA only at the end of the provocation phase, while another group received additional treatment during the first half of the provocation phase. Similar to the acute and therapeutic models, both treatment strategies resulted in a mitigated asthma phenotype. In addition to a generally weaker inflammatory response in the lungs and airways, a reduced airway restructuring was observed in VacA-treated animals. Interestingly, short-term VacA treatment at the end of the provocation phase was associated with the induction of Tregs and reduced DC activation, while long-term VacA therapy (during and at the end of the provocation phase) led to a reduced formation of CD4+ and CD8+ memory T cells in the lungs. To delve deeper into the mechanism of VacA and assess its potential effectiveness in humans, its impact on murine and DC was examined in vitro. In both murine and human DC, VacA treatment activated the cells, characterized by increased expression of proinflammatory surface markers CD80, CD40, and CD86. In the human model, it was demonstrated that, in addition to proinflammatory proteins, the expression of anti-inflammatory receptors such as PD-L1, PD-1, and ILT-3 was also increased. At the cytokine level, it was shown in both models that the anti-inflammatory cytokine interleukin (IL)-10 was more pronounced in the supernatant of VacA-treated cells. Interestingly, cultivating VacA-treated DC with autologous T cells induced the generation of Tregs. The results indicated that VacA had a comparable effect on murine and human DC and confirmed that the molecule could potentially be immunologically effective in humans through the modulation of DC and induction of Tregs. To investigate whether VacA also induced an anti-inflammatory DC phenotype in vivo, mice were administered VacA i.p., and the expression of anti-inflammatory receptors was examined 24 and 48 hours later. An increase in PD-L1 on dendritic cells in the lungs and spleen was observed after 24 hours, and this effect was still detectable in the spleen after 48 hours. The data from the preclinical analyses in both publications show that VacA is suitable not only for prophylactic but also for therapeutic treatment of allergic respiratory diseases. VacA not only has a positive effect on suppressing acute inflammatory responses but can also counteract the development of structural changes, such as the formation of mucus-producing goblet cells or subepithelial collagen deposits. The anti-inflammatory effect is mediated through modulation of the DC response and induction of Tregs. Since this anti-inflammatory effect was also observed in human cells in vitro, it is likely that the molecule could be effective not only in mice but also in humans. The analysis of different routes of administration demonstrates that VacA could be effectively administered orally, for example, as a tablet, or via inhalation with an inhaler, in addition to injection. In all experimental procedures, no negative side effects were observed. The results highlight the suitability of the bacterial protein as a potential new therapeutic agent. In the future, it could be used as an addition to existing asthma treatment options or even as a replacement. It is also conceivable that the immunoregulatory mechanism of VacA may be beneficial not only for asthma but also for other conditions characterized by excessive immune responses. Further optimization of formulations and preclinical studies on efficacy and cytotoxicity will be the next steps toward clinical trials that will demonstrate the suitability of the therapeutic VacA in humans.