Efficient and Sensitive Effect-directed Analysis of Endocrine and Neurotoxic Effects in Aqueous Samples Using High-performance Thin-layer Chromatography in Combination with Effect-based Methods
methods with chromatographic techniques makes it possible to focus on the effect-relevant parts of a sample.
In this work, high-performance thin-layer chromatography (HPTLC) was combined with an innovative transgenic yeast assay (yeast multi-endocrine effect screen), which allows the simultaneous determination of estrogenic, androgenic, and gestagenic effects on one HPTLC plate (HPTLC-YMEES). To determine neurotoxic effects an acetylcholinesterase inhibition (AChE-I) assay was also coupled to HPTLC (HPTLC-AChE-I). Sensitivity, precision and efficiency are in the focus of the investigations in order to enable an application-oriented and efficient detection of endocrine and neurotoxic environmental pollution with the optimized methods. Two methods for application of the yeast suspension and AChE solution on HPTLC plates, spraying and immersion, were compared using dose-response relationships for reference substances. A chemical oxidation step was integrated in HPTLC-AChE-I to achieve higher sensitivity to organothiophosphates (OTPs). Wastewater, stormwater, and surface water samples were analyzed with the two bioassays after chromatographic separation using HPTLC. In particular, the influence of stormwater-dependent discharges was investigated.
Both methods allow reliable detection of environmentally relevant concentrations of the reference hormones and OTPs analyzed. Nevertheless, a further increase in sensitivity is desirable to avoid high enrichment. Compared to the immersion method, a higher sensitivity was achieved by spraying the yeast suspension or AChE solution onto HPTLC plates. An optimized spraying procedure resulted in a more homogeneous distribution of yeast cells on the HPTLC plate and the highest precision. Due to the higher sensitivity and precision, it is recommended to spray yeast cells onto HPTLC plates. In contrast, despite the slightly higher sensitivity of the spray method, it is recommended that the HPTLC plates be immersed in the AChE solution due to a higher efficiency. The ability to simultaneously determine three endocrine effects on one HPTLC plate is very efficient and therefore well suited for a complex EDA, but requires further adjustments. The HPTLC-AChE-I approach was successfully extended by chemical oxidation with n-bromosuccinimide (HPTLC-Ox-AChE-I), which significantly increased the sensitivity to OTPs.
In the study of stormwater-dependent discharges it was found that combined sewer overflows can cause similar or even greater endocrine stress to receiving waters than wastewater treatment plants. In addition, an AChE-I effect in a stormwater basin connected to a highway was detected with the EDA used. However, this effect could not be assigned to a responsible substance by suspect and non-target high resolution mass spectrometry analysis, probably due to interfering substances and matrix
effects.
HPTLC-YMEES and HPTLC-Ox-AChE-I, are suitable for EDA and allow the detection of multiple endocrine and AChE inhibitory effects in surface water, stormwater and wastewater. HPTLC combined with effect-based methods is a useful method to detect effect-relevant parts of a sample and increase the probability of subsequent identification of the responsible substances by further analytical methods due to reduced sample complexity. EDA is one way to narrow the gap between inputs of substances to the aquatic environment versus the monitoring and assessment of those loads. With EDA, effects and responsible substances, both known and unknown, can be efficiently detected to increase knowledge of environmental contamination and provide the basis for appropriate mitigation strategies.
Die stetig steigende Produktion neuer synthetischer Stoffe sowie die Nutzung und Entsorgung hunderttausender von Substanzen für unterschiedlichste Anwendungsgebiete verstärkt den weiterhin global stattfindenden Eintrag schädlicher Stoffe in die Umwelt mit entsprechenden negativen Wirkungen für Flora, Fauna und den Menschen. Dies erfordert eine umfassende Überwachung und Bewertung, die über die derzeitigen Kapazitäten der chemischen und biologischen Analytik sowie der Ökotoxikologie hinausgeht. Die effekt-dirigierte Analytik (EDA) trägt dieser Diskrepanz Rechnung, indem sie sich an Wirkungen orientiert, ein breiteres Stoffspektrum als die herkömmliche Target‑Analytik abdeckt und eine zielgerichtete Analytik effektrelevanter Substanzen mit nachgeschalteten Analysemethoden ermöglicht. Eine EDA, die wirkungsbezogene Methoden mit chromatographischen Techniken kombiniert, ermöglicht eine Fokussierung auf effektrelevante Teile einer Probe.
In dieser Arbeit wurde die Hochleistungsdünnschichtchromatographie (HPTLC) mit einem innovativen transgenen Hefeassay (yeast multi-endocrine effect screen) kombiniert, der die gleichzeitige Bestimmung estrogener, androgener und gestagener Wirkungen auf einer HPTLC-Platte ermöglicht (HPTLC-YMEES). Zur Bestimmung von neurotoxischen Wirkungen wurde zudem ein Acetylcholinesterase-Hemmungstest mit der HPTLC verknüpft (HPTLC-AChE-I). Die Sensitivität, Präzision und Effizienz stehen bei den Untersuchungen im Mittelpunkt, um mit den optimierten Methoden einen anwendungsbezogenen effizienten Nachweis von endokrinen und neurotoxischen Umweltbelastungen zu ermöglichen. Zwei Möglichkeiten die Hefesuspension und AChE-Lösung auf HPTLC-Platten aufzutragen, Sprühen und Tauchen, wurden mittels Dosis-Wirkungs-Beziehungen von Referenzsubstanzen verglichen. Der HPTLC-AChE-I wurde um eine chemische Oxidation erweitert, um eine höhere Sensitivität gegenüber Organothiophospahten (OTPs) zu erreichen. Abwasser-, Regenwasser- und Oberflächenwasserproben wurden mit den beiden Bioassays nach chromatographischer Auftrennung mittels HPTLC analysiert. Insbesondere der Einfluss von regenabhängigen Einleitungen wurde untersucht.
Beide Methoden ermöglichen den zuverlässigen Nachweis umweltrelevanter Konzentrationen der untersuchten Referenzhormone und OTPs. Dennoch ist eine weitere Steigerung der Sensitivität wünschenswert, um eine hohe Anreicherung zu vermeiden. Im Vergleich zur Tauchmethode wurde eine höhere Sensitivität erreicht, indem die Hefesuspension oder AChE-Lösung auf HPTLC-Platten gesprüht wurde. Ein optimiertes Sprühverfahren führte zu einer gleichmäßigeren Verteilung der Hefezellen auf der HPTLC-Platte und ergab die höchste Präzision. Aufgrund der höheren Sensitivität und Präzision wird empfohlen Hefezellen auf HPTLC-Platten zu sprühen. Im Gegensatz dazu wird trotz der etwas höheren Sensitivität der Sprühmethode aufgrund einer höheren Effizienz empfohlen, die HPTLC-Platten in die AChE-Lösung zu tauchen. Die Möglichkeit, drei endokrine Wirkungen gleichzeitig auf einer HPTLC-Platte zu bestimmen, ist sehr effizient und daher für eine komplexe EDA besonders geeignet, erfordert jedoch weitere Anpassungen. Der HPTLC-AChE-I Ansatz wurde erfolgreich durch eine chemische Oxidation mit N‑Bromsuccinimid erweitert (HPTLC-Ox-AChE-I), wodurch die Sensitivität gegenüber OTPs deutlich erhöht werden konnte.
Die Untersuchung von regenabhängigen Einleitungen ergab, dass Regenüberlaufbecken bei Regenwetter eine ähnliche oder sogar höhere endokrine Belastung des Vorfluters im Vergleich zu Kläranlagen verursachen können. Zudem wurde mit der verwendeten EDA ein AChE-I Effekt in einem an eine Autobahn angeschlossenen Regenbecken detektiert. Allerdings konnte dieser Effekt mit der verwendeten suspect- und non-target Analytik unter Verwendung der hochauflösenden Massenspektrometrie, wahrscheinlich aufgrund von störenden Substanzen und Matrixeffekten, keiner verantwortlichen Substanz zugeordnet werden.
HPTLC-YMEES und HPTLC-Ox-AChE-I eignen sich für eine EDA und ermöglichen die Detektion von mehreren endokrinen und AChE hemmenden Effekten in Oberflächen-, Regen- und Abwasser. Die HPTLC in Kombination mit wirkungsbezogener Analytik ist eine sinnvolle Methode effektrelevante Teile einer Probe zu detektieren und aufgrund der reduzierten Probenkomplexität die Wahrscheinlichkeit einer nachfolgenden Identifizierung verantwortlicher Substanzen mit weiteren analytischen Methoden zu erhöhen. Die EDA ist eine Möglichkeit die Lücke, die zwischen dem Eintrag von Substanzen in die aquatische Umwelt und dem Monitoring und der Bewertung dieser Belastungen besteht, zu verkleinern. Mit der EDA können Wirkungen und verantwortliche bekannte, aber auch unbekannte Substanzen effizient erfasst werden, um so das Wissen über Umweltbelastungen zu erweitern und eine Grundlage für geeignete Vermeidungsstrategien zu schaffen.