Entwicklung und Optimierung einer auf Massenspektrometrie basierten Fettsäureanalytik für die Systembiologie, Medizin und Ernährung

Zusammenfassung

Fettsäuren erfüllen wichtige Rollen in biologischen Systemen, sie dienen als Energiespeicher, Hormone, Bausteine größerer Lipide und haben essenzielle Aufgaben beim interzellularen Transport von Proteinen. Als Konsequenz werden in verschiedenen Bereichen Methoden für eine sensitive Fettsäureanalytik benötigt. Dazu zählen die Aufklärung von Krankheiten, die Beantwortung von ernährungsphysiologischen Fragestellungen, die Identifikation von Lebensmittelfälschungen oder die Untersuchung evolutionsbiologischer Zusammenhänge.

Solche Fragestellungen erfordern eine Methode, welche eine sensitive und selektive Identifikation und Quantifizierung von Fettsäuren in verschiedenen Matrices ermöglicht. Anstelle der im gaschromatographischen Bereich klassischerweise verwendeten Elektronenstoßionisation von Fettsäuremethylestern wurde eine Derivatisierung der Fettsäuren mittels Pentafluorobenzylbromid durchgeführt, welche anschließend mit verschiedenen Ionenquellen ionisiert wurden. Hierbei wurde die üblicherweise bei dieser Derivatisierung verwendete Negative Ion Chemical Ionization mit zwei modernen Atmosphärendruckquellen verglichen. Es konnte gezeigt werden, dass die Atmospheric Pressure Chemical Ionization (APCI) sowohl sensitiver ist, und zudem deutlich geringere Unterschiede bei der Ionisationseffizienz der analysierten Fettsäuren aufweist. Die optimierte und validierte APCI-Methode wurde anschließend verwendet, um zwei Studien zur Tumordiagnostik analytisch zu unterstützen. Die Tumorzellen wiesen hierbei signifikante Unterschiede in der Fettsäurekonzentration auf.

Die entwickelte GC-APCI-MS-Methode wurde genutzt, um verschiedene Archaeen auf Fettsäuren zu untersuchen. Archaeen bilden eine eigene Domaine des Lebens, welche sich in ihrem Lipidom von anderen Organismen stark unterscheidet. Bei Archaeen war, anders als bei Eukaryonten und Bakterien, jedoch noch nicht geklärt, ob diese in der Lage sind, Fettsäuren zu bilden, und wenn ja, welchen quantitativen Anteil diese ausmachen. Um dies zu untersuchen, wurden verschiedene Archaeen auf einem 13C-markierten Nährmedium kultiviert, und die in den Zellen enthaltende 13C-markierte Fettsäuren wurden identifiziert. Es konnte gezeigt werden, dass Archaeen in der Lage sind Fettsäuren zu bilden und dass das Nährmedium dabei eine wesentliche Rolle spielt, wobei die gebildeten Fettsäuren gattungsabhängig sind. In Sulfolobus acidocaldarius wurden Caprylsäure (FA 8:0), Caprinsäure (FA 10:0) und Laurinsäure (FA 12:0) identifiziert und quantifiziert, während in Haloferax volcanii vor allem Palmitinsäure (FA 16:0) vorliegt.

Neben der Kettenlänge hat bei ungesättigten Fettsäuren auch die Anzahl und die Position der Doppelbindungen einen Einfluss auf ihre physiologische Wirkung. Während die Anzahl der Doppelbindungen anhand des Masse-zu-Ladungsverhältnisses der ionisierten Fettsäure bestimmt werden kann, ist die Bestimmung der Doppelbindungsposition analytisch herausfordernder. Fettsäureisomere weisen häufig nur geringe Polaritätsunterschiede auf, wodurch eine chromatographische Trennung oft nur durch die Verwendung von langen Säulen und damit verbundenen langen Analysezeiten erreicht werden kann. Um die Detektion der Fettsäureposition zu vereinfachen, wurde die entwickelte GC-APCI-MS-Methode modifiziert, indem Benzaldehyd als Reaktant in die Ionenquelle eingebracht wurde. Hierdurch wurde die Bildung von regiospezifischen in-source-Fragmenten unterstützt, welche für die Bestimmung der Doppelbindungsposition genutzt werden können. Die Leistungsfähigkeit der Methode wurde anschließend anhand der Analyse von Fischölen demonstriert. Diese enthalten verschiedene mehrfach ungesättigte Fettsäuren, wie zum Beispiel die ω3-Fettsäuren Eicosapentaensäure (FA 20:5) und Docosahexaensäure (FA 22:6) sowie einige weniger bekannte Fettsäuren wie Hexadecatriensäure (FA 16:3), Hexadecatetraensäure (FA 16:4) oder Stearidonsäure (FA 18:4). Mit der entwickelten Methode konnten innerhalb einer Messung diese Fettsäuren nachgewiesen, quantifiziert und deren Doppelbindungspositionen bestimmt werden. Die Methode stellt daher eine wertvolle Ergänzung zu der üblicherweise verwendeten Ozonolyse und Paternò-Büchi-Reaktion dar, da sie eine selektive Identifikation der Doppelbindungsreaktion mit geringem Aufwand ermöglicht.

 

Abstract

Fatty acids fulfill various important roles in biological systems. They can serve as energy storage, hormones, building blocks of more complex lipids and assist in the intercellular transport of proteins. Therefore, sensitive methods for fatty acid analysis are required in various area. This includes the identification of illnesses, nutritional-physiological questions, the identification of food fraud, and evolutionary developments of organisms.

Due to this, a sensitive and selective method for analyzing fatty acid in different matrices is required. In the field of gas chromatographic analysis, electron impact ionization of fatty acid methylester is commonly used. An alternative is the derivatization using pentafluorobenzyl bromide which has been used in combination with various ion sources. The traditional used negative ion chemical ionization was compared with two modern atmospheric pressure sources. It was able to demonstrate that atmospheric pressure chemical ionization (APCI) is more sensitive and provides more uniform ionization of the analyzed fatty acids. The optimized and validated method was then used for two studies in the field of diagnostics. Significant differences in the fatty acid concentration of the analyzed tumor cells were identified.

The optimized GC-APCI-MS method was used to analyze fatty acids in archaea. Archaea are one of the three domains of life and their lipidome differs significantly from the other two domains. Until now, it was not clear whether archaea are able to synthesize fatty acids. To target that, archaea were cultivated on different 13C-labeled media and the 13C-labeled fatty acids were analyzed. The ability to synthesize fatty acids could be proofed for archaea. Both the media and the species both have an high influence on the fatty acid synthesis in archaea. Caprylic acid (FA 8:0) caprinic acid (FA 10:0 and laurinic acid were identified and quantified in Sulfolobus acidocaldarius, while palmitic acid (FA 16:0) was the most dominant fatty acid in Haloferax volcanii.

The number and the position of double bonds play an important role in the physiological effects of fatty acids. While the number of double bonds can be determined from the mass-to-charge ratio of the ionized fatty acid, determining the position of these double bonds is much more challenging. The chromatographic separation of fatty acid isomers is often difficult and requires long analysis times. To simplify this, the GCAPCI-MS method has been modified using benzaldehyde as a reactant. This promotes a regiospecific in-source fragmentation, which can be used for double bond position determination. The performance of this method was demonstrated by the analyzis of fish oil. Several rare fatty acids such as hexadecatrienic acid (FA 16:3), hexadecatetraenic acid (FA 16:4) or stearidonic acid (FA 18:4) were identified, quantified and the double bond position was confirmed by the regiospecific fragments. This method represents a fast and simple approach, complementing the existing methods such as the Paternò-Büchi reaction and ozonolysis.

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