Die Grundlagen der spezifischen radiobiologischen Effekte von Laser-induzierten Protonen im Vergleich zu Röntgenstrahlen: Stärkere HR-Rekrutierung an Doppelstrangbrüchen
Ziel der vorliegenden Studie war es zunächst, weitere Einblicke in die biologische Antwort der Zelle auf Bestrahlung mit Laserbeschleunigten Protonen (LAP) zu gewinnen. Die Motivation dahinter war es, eine preisgünstigere Alternative zur Protonenbeschleunigung zu finden, im Vergleich zu herkömmlichen Beschleunigern. Die Ergebnisse zeigen, dass die LAP ein ähnliches Ausmaß an Zellschädigung vorweisen, wie klinische Protonen (CAP) und Röntgenstrahlen. Betrachtet wurden dabei das Zellschädigungspotenzial in Form von DSB-Indizierung und das Zellüberleben nach Bestrahlung. Sie spiegeln allerdings nur die oberflächliche Reaktion der Zelle wider, da explizite Art der Schädigung und die nachgelagerte Aktivierung der Reparaturwege nicht berücksichtigt werden, ebenso wenig wie die Abhängigkeit vom Zellzyklus. Die Versuchsanordnung für die LAP-Bestrahlung ließ diese Art von Experimenten nicht zu und muss in künftigen Studien untersucht werden. Der eigentliche Schwerpunkt war es, die Radikalbildung nach Bestrahlung mit LAP und CAP zu beobachten, wobei dies nicht im Aufgabenbereich unserer Arbeitsgruppe lag und von den kooperierenden Arbeitsgruppen in Angriff genommen wurde. Für uns war es die Überlegung, den Einfluss auf die Radikalbildung mit Hilfe von Fricke-Dosimetrie zu untersuchen bei der die Methode der Dosismessung auf Radikalbildung durch ionisierende Strahlung beruht. Aufgrund der niedrigen Eindringtiefe der LAP konnte diese Methode nicht für diese Strahlenart verwendet werden.
Es wurde allerdings aufgrund der physikalischen Eigenschaften davon ausgegangen, dass FLASH-Protonen durch ihre erhöhten Dosisleistung einen ähnlichen Effekt aufweisen wie LAP, die sich ebenfalls durch ihre hohe Dosisleistung auszeichnen. Die Ergebnisse für die Fricke-Dosimetrie, die mit dem experimentellen Aufbau zur FLASH-Bestrahlung durchführbar war, zeigte keinen Unterschied in der Indizierung von Fe(III)-Molekülen. Auch die Versuchsreihen zur Untersuchung der biologischen Antwort zeigten wenig Unterschied zwischen FLASH-Protonen und CAP, bezüglich des Zellschädigungspotenzials in Form von DSB-Indizierung. Also dasselbe Ergebnis wie für LAP. Eine Erklärung, die in der Literatur dazu gefunden wurde, war der uneingeschränkte Zugang zum Umgebungssauerstoff, da davon ausgegangen wurde, dass der FLASH Effekt darin liegt, dass durch die hohe Dosisleistung eine höhere Radikalentwicklung und dadurch eine künstlich anoxische Bedingung innerhalb der Zelle erzeugt wird. Es gab allerdings keinen experimentellen Aufbau, mit dem wir die Theorie bestätigen konnten. Aber obwohl keine eindeutigen Ergebnisse erzielt wurden, so haben alle Ergebnisse die Tendenz, dass die Zellen, die mit LAP oder FLASH-Protonen bestrahlt wurden, sich mehr Verhalten wie die Ergebnisse nach Bestrahlung mit Röntgenstrahlen als nach der Bestrahlung mit CAP. Das deutet nicht nur auf einen Unterschied in der Bestrahlung zwischen Protonen und Photonen hin, was späterhin auf einen Unterschied in der Wahl des Reparaturwegs zurückgeführt wird, sondern auch, dass LAP und FLASH-Protonen ebenfalls einen Einfluss auf die Wahl der Reparatur haben. Dies konnte zum jetzigen Zeitpunkt allerdings nicht untersucht werden.
Eine weitere Überlegung ist es gewesen, dass LAP aufgrund Clusterbildung auch einen erhöhten LET besitzen. In diesem Zuge wurde zum Vergleich α-Strahlung herangezogen, die vergleichsweise zu CAP und Röntgenstrahlen einen sehr hohen LET besitzt. Die Ergebnisse bezüglich des Zellschädigungspotentials sind auf die Ergebnisse mit der Pulsfeldgelelektrophorese (PFGE) zu beschränken, da die Ergebnisse mit γ-H2AX aufgrund der Bestrahlungseigenschaften von α-Teilchen nicht auszuwerten waren. Das Potential zur Erzeugung von DSB unterscheidet sich nicht zwischen Röntgenstrahlen und α-Strahlung. Dabei wäre interessant zu sehen, wie sich das auf die Entstehung von Thermisch labilen Stellen auswirkt, doch aufgrund des problematischen Versuchsaufbaus, konnte diese Versuchsreihe weder für LAP, noch für α-Teilchen effektiv durchgeführt werden. Die Ergebnisse zum Zellüberleben zeigen allerdings deutlich, dass der hohe LET einen starken Effekt auf das Zellüberleben aufweist. Dieser Effekt konnte bei LAP nicht gesehen werden, was einen stark erhöhten LET aufgrund der Clusterbildung ausschließt. Wenn die Tendenz des Ergebnisses des Zellüberlebens mit LAP stimmt, hätten sie zumindest einen leicht erhöhten LET und damit einen erhöhten RBE.
Da aufgrund des pandemischen Einflusses nicht alle Versuche durchgeführt werden konnten, die uns mit LAP interessiert hätten, wurde das Augenmerk auf die Wahl des Reparaturweges nach Bestrahlung mit klinischen Protonen und Röntgenstrahlen gelegt. Erste Ergebnisse (s.o.) haben bereits angedeutet, dass es leichte Unterschiede zwischen diesen Bestrahlungsarten in der Zellschädigung gibt, die vermutlich auf eine unterschiedliche Reparatur zurückzuführen sind. Die weiteren Ergebnisse der Arbeit bestätigen dies, da festgestellt werden konnte, dass sich der G2-Checkpoint innerhalb des Zellzyklus anders verhält im Bezug auf Protonenstrahlung und Röntgenstrahlung. Die Besonderheit hierbei ist, dass in der G2-Phase sowohl die HR und das NHEJ aktiv sind, während in der G1-Phase die HR inaktiv ist. Bei den meisten Experimenten werden Zellen verwendet, die sich normal im Zellzyklus befinden. Dadurch werden zum Großteil Zellen bestrahlt, die sich in der G1-Phase befinden und damit nicht der HR ausgesetzt sind. Bei der Betrachtung des G2-Checkpoints geht es hauptsächlich um die Zellen, die in der G2-Phase bestrahlt wurden. Außerdem gibt es Studien, die zeigen, dass der G2-Checkpoint direkt mit der HR verknüpft ist. Die Ergebnisse, die das näher betrachten, indem die Zellen in der G2-Phase synchronisiert werden und anschließend auf das Zellüberleben hin untersucht werden, zeigen, dass mehr Zellen nach Protonenstrahlung überleben, als nach Röntgenstrahlung, mit dem Verdacht, dass es an einer gesteigerten Aktivität der HR liegt. Dies wurde bestätigt, indem das Protein Rad51 untersucht wurde, dass direkter Bestandteil der HR ist und nach Protonenbestrahlung in vermehrter Anzahl auftaucht. Im Vergleich zu der Anzahl an γ-H2AX, die die Schädigungen als solche anzeigen, zeigt es, dass HR aktiver nach Bestrahlung mit Protonen, als nach Bestrahlung mit Röntgenstrahlen ist.
Bei der letzten Versuchsreihe, die gemacht wurde, wurde die Entstehung von thermisch labilen Stellen genauer untersucht und den Einfluss an Radikalen. Dies ist ebenfalls auf die Untersuchung mit LAP zurückzuführen, da die Vermutung im Raum stand, dass LAP einen Einfluss auf die Radikalentstehung hat. In diesem Fall wurden die Zellen unter anoxischen Bedingungen bestrahlt, um den Einfluss von Sauerstoff, bzw. ein Fehlen von diesem auf die Entstehung von thermisch labilen Stellen zu untersuchen. Die Ergebnisse deuten darauf hin, dass die Abwesenheit von O2 insgesamt die Menge an DSB verringert, aber im Verhältnis, die Menge an thermisch labilen Stellen, die zu DSB werden, erhöht. Die Ergebnisse deuten darauf hin, dass die thermisch labilen Stellen nicht nur durch einen Temperatureffekt brechen können, sondern auch durch ROS, was dafür sorgt, dass ein verringern der Temperatur in Kombination zur Verringerung an Sauerstoff die Induktion von DSB drastisch senkt. Außerdem lässt es die Vermutung nahe, dass manche TLSL brechen, wenn entweder ROS oder eine hohe Temperatur vorhanden ist, man also nicht das Brechen aller TLSL bei niedrigen Temperaturen verhindern kann, es sei denn man reduziert zusätzlich ROS. Umgekehrt gilt das genauso.
The aim of the present study was initially to gain further insights into the biological response of the cell to irradiation with laser-accelerated protons (LAP). The motivation behind this was to find a cheaper alternative to proton acceleration compared to conventional accelerators. The results show that LAPs have a similar extent of cell damage as clinical protons (CAP) and X-ray. The cell damage potential in the form of DSB indexing and cell survival after irradiation were examined. However, only the superficial reaction of the cell was reflected, as the explicit type of damage and the downstream activation of the repair pathways are not taken into account, nor is the dependence on the cell cycle. The experimental set-up for LAP irradiation did not allow for this type of experiment and needs to be investigated in future studies. The actual focus was to observe radical formation after irradiation with LAP and CAP, although this was not within the remit of our research group and was tackled by the cooperating research groups. We considered investigating the influence on radical formation using Fricke dosimetry, where the method of dose measurement is based on radical formation by ionizing radiation. Due to the low penetration depth of the LAP, this method could not be used for this type of radiation.
However, due to their physical properties, it was assumed that FLASH protons have a similar effect to LAP, which are also characterized by their high dose rate, due to their increased dose rate. The results for Fricke dosimetry, which could be carried out with the experimental setup for FLASH irradiation, showed no difference in the indexing of Fe(III) molecules. The series of experiments to investigate the biological response also showed little difference between FLASH protons and CAP in terms of cell damage potential in the form of DSB indexing. In other words, the same result as for LAP. One explanation found in the literature for this was the unrestricted access to ambient oxygen, as it was assumed that the FLASH effect is that the high dose rate produces higher radical generation and thus an artificially anoxic condition within the cell. However, there was no experimental setup with which we could confirm the theory. But although no clear results were obtained, all results tended to show that the cells irradiated with LAP or FLASH protons behaved more like the results after irradiation with X-ray than after irradiation with CAP. This indicates not only a difference in the irradiation between protons and photons, which is later attributed to a difference in the choice of repair pathway, but also that LAP and FLASH protons also have an influence on the choice of repair. However, this could not be investigated at the present time.
A further consideration was that LAP also have an increased LET due to cluster formation. In this context, α-radiation was used for comparison, which has a very high LET compared to CAP and X-ray. The results regarding the cell damage potential must be limited to the results with pulsed field gel electrophoresis (PFGE), as the results with γ-H2AX could not be evaluated due to the irradiation properties of α-particles. The potential for generating DSB does not differ between X-ray and α-radiation. It would be interesting to see how this affects the formation of thermally labile sites, but due to the problematic experimental setup, this series of experiments could not be carried out effectively for either LAP or α-particles. However, the results on cell survival clearly show that the high LET has a strong effect on cell survival. This effect could not be seen for LAP, which rules out a strongly increased LET due to clustering. If the tendency of the cell survival result with LAP is correct, they would have at least a slightly increased LET and thus an increased RBE.
As it was not possible to carry out all the experiments that would have interested us with LAP due to the pandemic, the focus was placed on the choice of repair pathway after irradiation with clinical protons and X-rays. Initial results (see above) have already indicated that there are slight differences in cell damage between these types of irradiations, which are presumably due to differences in repair. The further results of the work confirm this, as it was found that the G2 checkpoint behaves differently within the cell cycle in relation to proton radiation and X-ray radiation. The special feature here is that in the G2 phase both the HR and the NHEJ are active, while in the G1 phase the HR is inactive. In most experiments, cells are used that are normally in the cell cycle. This means that most of the cells irradiated are in the G1 phase and are therefore not exposed to HR. When looking at the G2 checkpoint, we are mainly concerned with the cells that were irradiated in the G2 phase. There are also studies that show that the G2 checkpoint is directly linked to HR. The results, which look at this in more detail by synchronizing the cells in the G2 phase and then examining them for cell survival, show that more cells survive after proton radiation than after X-ray radiation, with the suspicion that this is due to increased activity of the HR. This was confirmed by examining the protein Rad51, which is a direct component of the HR and appears in increased numbers after proton irradiation. In comparison to the number of γ-H2AX, which indicate the damage as such, it shows that HR is more active after irradiation with protons than after irradiation with X-rays.
In the last series of experiments carried out, the formation of thermally labile areas and the influence of radicals were investigated in more detail. This is also due to the investigation with LAP, as it was assumed that LAP has an influence on the formation of radicals. In this case, the cells were irradiated under anoxic conditions in order to investigate the influence of oxygen, or lack thereof, on the formation of thermally labile sites. The results indicate that the absence of O2 decreases the overall amount of DSB, but proportionally increases the amount of thermally labile sites that become DSB. The results suggest that the thermally labile sites can break not only by a temperature effect, but also by ROS, which ensures that a decrease in temperature in combination with a decrease in oxygen drastically lowers the induction of DSB. It also suggests that some TLSLs break when either ROS or high temperature is present, so you can't prevent all TLSLs from breaking at low temperatures unless you also reduce ROS. The reverse is also true.