Liquid chromatography with simultaneous isotope ratio and high-resolution mass spectrometry detection : a powerful new tool for process investigation
Compound-specific stable isotope analysis (CSIA) is a unique analytical technique used to study small variations in isotope ratios within individual compounds in complex mixtures. In liquid chromatography-isotope ratio mass spectrometry (LC-IRMS) based CSIA, for instance, all carbon of a compound is quantitatively converted to carbon dioxide for isotopic analysis, thus losing any structural information about the analytes. To overcome this limitation in conventional CSIA, a novel approach combining LC with simultaneous detection by IRMS and high-resolution mass spectrometry (HRMS) has been introduced, enabling the direct identification of unknown or coeluting species. The coupling was optimized using a variable post-column flow splitter, ensuring repeatability in peak areas, isotope values, and retention times. The applicability of the method was demonstrated by confirming the presence of pyroglutamic acid in glutamic acid, an international isotopic reference material (USGS41 and USGS41a), highlighting the impurity and urging caution when using it for isotopic calibration.
The strengths of the coupling as a powerful new tool for process investigation were demonstrated by studying the photolytic degradation of the phosphonate aminotrimethylphosphonic acid (ATMP) in aqueous solution. The use of phosphonates, known for their strong metal chelating properties, has increased worldwide and their presence in aquatic systems via industrial and domestic wastewater raises environmental concerns that are compounded by their persistence in traditional water treatment processes. The analysis using LC-IRMS+HRMS coupling provided quantitative data on degradation, carbon CSIA and identification of transformation products (TPs). Combined with ortho-phosphate determination, a complete mass balance of the degradation process could be established. The carbon kinetic isotope effect (KIE) allowed differentiation between direct photolysis and/or hydroxyl radical oxidation of ATMP during photolysis. Chemical structures for so far unknown TPs were postulated based on the accurate masses obtained by HRMS.
Furthermore, the effects of pH-dependent speciation on the photolysis of ATMP and its TPs, iminodimethylphosphonic acid (IDMP) and aminomethylphosphonic acid (AMPA), were investigated. While the rate constants of ATMP show an influence of pH, IDMP and AMPA show a direct correlation of the rate constants with the pH value. The analysis of the KIE of carbon shows an inverse KIE for ATMP, whereas a normal KIE is observed for IDMP and AMPA. Quantum chemical calculations provide valuable insights for interpreting the degradation pathways and understanding KIEs. Energy barrier calculations differentiated between N-C and C-P bond cleavage, with N-C cleavage being the preferred reaction on average, consistent with the experimentally observed TPs. Additional calculations on possible transition states provide promising approaches to explain the different KIEs. To gain a better understanding of the behavior and fate of phosphonates in the environment, it is crucial to conduct experiments under environmentally relevant conditions. In addition to previously investigated parameters, such as pH, the presence of dissolved divalent metal cations has a significant impact. In general, further experimental studies in combination with theoretical calculations regarding the photolysis of compounds and the associated KIEs are necessary to verify the hypotheses proposed.
Recent instrumental developments utilize Orbitrap systems for stable isotope analysis. Besides liquid direct infusion applications, first studies on direct elution methods using GC-Orbitrap for CSIA are already available. For LC-based CSIA, there are currently no established approaches for direct elution and detection by ESI-Orbitrap mass analyzers. This study examines the use of an Orbitrap system for CSIA, with a focus on L-glutamic acid as a model compound. Orientation experiments using direct infusion were used to investigate the effects of resolution settings on isotope separation and the influence of flow rates and methanol content in the sample solutions. Insights into the challenges involved in analyzing eluting peaks were gained through subsequent injection experiments. The obtained results underscore the need for additional examination and integration of a simultaneous detection using classical sector field IRMS for validation purposes. This can be achieved with the LC-IRMS+HRMS coupling presented here. In general, this study offers valuable insights into the utilization of Orbitrap technology for advancing CSIA.
The strengths of the coupling as a powerful new tool for process investigation were demonstrated by studying the photolytic degradation of the phosphonate aminotrimethylphosphonic acid (ATMP) in aqueous solution. The use of phosphonates, known for their strong metal chelating properties, has increased worldwide and their presence in aquatic systems via industrial and domestic wastewater raises environmental concerns that are compounded by their persistence in traditional water treatment processes. The analysis using LC-IRMS+HRMS coupling provided quantitative data on degradation, carbon CSIA and identification of transformation products (TPs). Combined with ortho-phosphate determination, a complete mass balance of the degradation process could be established. The carbon kinetic isotope effect (KIE) allowed differentiation between direct photolysis and/or hydroxyl radical oxidation of ATMP during photolysis. Chemical structures for so far unknown TPs were postulated based on the accurate masses obtained by HRMS.
Furthermore, the effects of pH-dependent speciation on the photolysis of ATMP and its TPs, iminodimethylphosphonic acid (IDMP) and aminomethylphosphonic acid (AMPA), were investigated. While the rate constants of ATMP show an influence of pH, IDMP and AMPA show a direct correlation of the rate constants with the pH value. The analysis of the KIE of carbon shows an inverse KIE for ATMP, whereas a normal KIE is observed for IDMP and AMPA. Quantum chemical calculations provide valuable insights for interpreting the degradation pathways and understanding KIEs. Energy barrier calculations differentiated between N-C and C-P bond cleavage, with N-C cleavage being the preferred reaction on average, consistent with the experimentally observed TPs. Additional calculations on possible transition states provide promising approaches to explain the different KIEs. To gain a better understanding of the behavior and fate of phosphonates in the environment, it is crucial to conduct experiments under environmentally relevant conditions. In addition to previously investigated parameters, such as pH, the presence of dissolved divalent metal cations has a significant impact. In general, further experimental studies in combination with theoretical calculations regarding the photolysis of compounds and the associated KIEs are necessary to verify the hypotheses proposed.
Recent instrumental developments utilize Orbitrap systems for stable isotope analysis. Besides liquid direct infusion applications, first studies on direct elution methods using GC-Orbitrap for CSIA are already available. For LC-based CSIA, there are currently no established approaches for direct elution and detection by ESI-Orbitrap mass analyzers. This study examines the use of an Orbitrap system for CSIA, with a focus on L-glutamic acid as a model compound. Orientation experiments using direct infusion were used to investigate the effects of resolution settings on isotope separation and the influence of flow rates and methanol content in the sample solutions. Insights into the challenges involved in analyzing eluting peaks were gained through subsequent injection experiments. The obtained results underscore the need for additional examination and integration of a simultaneous detection using classical sector field IRMS for validation purposes. This can be achieved with the LC-IRMS+HRMS coupling presented here. In general, this study offers valuable insights into the utilization of Orbitrap technology for advancing CSIA.
Die verbindungsspezifische Analyse stabiler Isotope (CSIA) ist ein spezielles Analyseverfahren, mit dem kleine Variationen der Isotopenverhältnisse innerhalb einzelner Verbindungen in komplexen Mischungen untersucht werden können. Im Falle der CSIA, die auf der Flüssigchromatographie-Isotopenverhältnis-Massenspektrometrie (LC-IRMS) basiert, wird der Kohlenstoff eines Analyten für die Isotopenanalyse quantitativ in Kohlenstoffdioxid umgewandelt, wodurch jegliche Strukturinformation über den Analyten verloren geht. Um die Einschränkungen konventioneller CSIA zu überwinden, wurde ein neuer Ansatz entwickelt, der die LC mit IRMS und hochauflösender Massenspektrometrie (HRMS) kombiniert und so die direkte Identifizierung unbekannter oder koeluierender Spezies ermöglicht. Die Kopplung wurde mit einem variablen Nachsäulen-Durchflusssplitter optimiert, um die Wiederholbarkeit der Peakflächen, Isotopenwerte und Retentionszeiten zu gewährleisten. Durch den Nachweis von Pyroglutaminsäure in Glutaminsäure, einem internationalen Isotopenreferenzmaterial (USGS41 und USGS41a), wurde die Anwendungsmöglichkeit der Methode bestätigt und es wurde vor der Verwendung des Materials für Kalibrierungszwecke gewarnt.
Die Stärken der Kopplung als leistungsfähiges neues Werkzeug zur Prozessuntersuchung wurden durch die Untersuchung des photolytischen Abbaus des Phosphonats Aminotrimethylphosphonsäure (ATMP) in wässriger Lösung demonstriert. Der Einsatz von Phosphonaten, bekannt für ihre stark chelatbildenden Eigenschaften, hat weltweit zugenommen und ihr Eintrag in aquatische Systeme über industrielle und häusliche Abwässer gibt Anlass zu Umweltbedenken. Diese werden durch ihre Persistenz in konventionellen Wasseraufbereitungsverfahren noch verstärkt. Die Analyse mittels LC-IRMS+HRMS-Kopplung lieferte quantitative Daten bezüglich des Abbaus, der Kohlenstoff-CSIA und der Identifizierung von Transformationsprodukten (TPs). In Kombination mit der Bestimmung von ortho-Phosphat konnte eine vollständige Massenbilanz über den Abbauprozess erstellt werden. Der kinetische Isotopeneffekt (KIE) von Kohlenstoff ermöglichte die Unterscheidung zwischen direkter Photolyse und/oder Hydroxylradikaloxidation von ATMP während der Photolyse. Chemische Strukturen bisher unbekannter TPs wurden anhand der mit HRMS bestimmten Massen postuliert.
Darüber hinaus wurden Auswirkungen der pH-abhängigen Speziation auf die Photolyse von ATMP und dessen TPs Iminodimethylphosphonsäure (IDMP) und Aminomethylphosphonsäure (AMPA) untersucht. Die Geschwindigkeitskonstanten von ATMP zeigen einen Einfluss des pH-Wertes, während bei IDMP und AMPA eine direkte Korrelation zwischen Geschwindigkeitskonstanten und dem pH-Wert besteht. Die Analyse der KIE von Kohlenstoff zeigt einen inversen KIE für ATMP, während für IDMP und AMPA ein normaler KIE beobachtet wird. Quantenchemische Berechnungen liefern wertvolle Erkenntnisse zur Interpretation der Abbaupfade und zum Verständnis der KIEs. Die berechneten Energiebarrieren zeigten Unterschiede zwischen der N-C- und C-P-Bindungsspaltung, wobei die N-C-Spaltung im Mittel die bevorzugte Reaktion war, was mit den experimentell beobachteten TPs übereinstimmt. Zusätzliche Berechnungen zu möglichen Übergangszuständen bieten vielversprechende Ansätze zur Erklärung der unterschiedlichen KIEs. Für ein besseres Verständnis des Verhaltens und Verbleibs von Phosphonaten in der Umwelt ist es von entscheidender Bedeutung, Versuche unter umweltrelevanten Bedingungen durchzuführen. Neben den bereits untersuchten Parametern wie dem pH-Wert hat die Anwesenheit gelöster zweiwertiger Metallkationen einen signifikanten Einfluss. Generell sind weitere experimentelle Studien in Kombination mit theoretischen Berechnungen zur Photolyse von Verbindungen und den damit verbundenen KIEs erforderlich, um die vorgeschlagenen Hypothesen zu überprüfen.
Neuste instrumentelle Entwicklungen nutzen Orbitrap-Systeme für die Analyse stabiler Isotope. Neben Anwendungen für die Direktinfusion von Flüssigkeiten liegen erste Studien über Methoden zur Direktelution mit GC-Orbitrap für CSIA vor. Für LC-basierte CSIA gibt es derzeit keine etablierten Ansätze für die direkte Elution und Detektion mit ESI-Orbitrap. In dieser Studie wird die Verwendung eines Orbitrap-Systems für CSIA untersucht, wobei L-Glutaminsäure als Modellverbindung dient. Durch Orientierungsexperimente mit direkter Infusion wurden die Auswirkungen der Auflösungseinstellungen auf die Isotopentrennung sowie der Einfluss der Flussraten und des Methanolgehalts in Probenlösungen untersucht. Anschließende Injektionsversuche gaben Aufschluss über die Herausforderungen bei der Analyse eluierender Peaks. Die Ergebnisse betonen die Notwendigkeit weiterer Untersuchungen und der Integration eines simultanen Nachweises unter Verwendung eines klassischen Sektorfeld-IRMS zu Validierungszwecken. Dies kann mithilfe der hier vorgestellten Kopplung aus LC-IRMS+HRMS erreicht werden. Im Allgemeinen bietet diese Studie wertvolle Einblicke in den Einsatz der Orbitrap-Technologie für die Weiterentwicklung der CSIA.
Die Stärken der Kopplung als leistungsfähiges neues Werkzeug zur Prozessuntersuchung wurden durch die Untersuchung des photolytischen Abbaus des Phosphonats Aminotrimethylphosphonsäure (ATMP) in wässriger Lösung demonstriert. Der Einsatz von Phosphonaten, bekannt für ihre stark chelatbildenden Eigenschaften, hat weltweit zugenommen und ihr Eintrag in aquatische Systeme über industrielle und häusliche Abwässer gibt Anlass zu Umweltbedenken. Diese werden durch ihre Persistenz in konventionellen Wasseraufbereitungsverfahren noch verstärkt. Die Analyse mittels LC-IRMS+HRMS-Kopplung lieferte quantitative Daten bezüglich des Abbaus, der Kohlenstoff-CSIA und der Identifizierung von Transformationsprodukten (TPs). In Kombination mit der Bestimmung von ortho-Phosphat konnte eine vollständige Massenbilanz über den Abbauprozess erstellt werden. Der kinetische Isotopeneffekt (KIE) von Kohlenstoff ermöglichte die Unterscheidung zwischen direkter Photolyse und/oder Hydroxylradikaloxidation von ATMP während der Photolyse. Chemische Strukturen bisher unbekannter TPs wurden anhand der mit HRMS bestimmten Massen postuliert.
Darüber hinaus wurden Auswirkungen der pH-abhängigen Speziation auf die Photolyse von ATMP und dessen TPs Iminodimethylphosphonsäure (IDMP) und Aminomethylphosphonsäure (AMPA) untersucht. Die Geschwindigkeitskonstanten von ATMP zeigen einen Einfluss des pH-Wertes, während bei IDMP und AMPA eine direkte Korrelation zwischen Geschwindigkeitskonstanten und dem pH-Wert besteht. Die Analyse der KIE von Kohlenstoff zeigt einen inversen KIE für ATMP, während für IDMP und AMPA ein normaler KIE beobachtet wird. Quantenchemische Berechnungen liefern wertvolle Erkenntnisse zur Interpretation der Abbaupfade und zum Verständnis der KIEs. Die berechneten Energiebarrieren zeigten Unterschiede zwischen der N-C- und C-P-Bindungsspaltung, wobei die N-C-Spaltung im Mittel die bevorzugte Reaktion war, was mit den experimentell beobachteten TPs übereinstimmt. Zusätzliche Berechnungen zu möglichen Übergangszuständen bieten vielversprechende Ansätze zur Erklärung der unterschiedlichen KIEs. Für ein besseres Verständnis des Verhaltens und Verbleibs von Phosphonaten in der Umwelt ist es von entscheidender Bedeutung, Versuche unter umweltrelevanten Bedingungen durchzuführen. Neben den bereits untersuchten Parametern wie dem pH-Wert hat die Anwesenheit gelöster zweiwertiger Metallkationen einen signifikanten Einfluss. Generell sind weitere experimentelle Studien in Kombination mit theoretischen Berechnungen zur Photolyse von Verbindungen und den damit verbundenen KIEs erforderlich, um die vorgeschlagenen Hypothesen zu überprüfen.
Neuste instrumentelle Entwicklungen nutzen Orbitrap-Systeme für die Analyse stabiler Isotope. Neben Anwendungen für die Direktinfusion von Flüssigkeiten liegen erste Studien über Methoden zur Direktelution mit GC-Orbitrap für CSIA vor. Für LC-basierte CSIA gibt es derzeit keine etablierten Ansätze für die direkte Elution und Detektion mit ESI-Orbitrap. In dieser Studie wird die Verwendung eines Orbitrap-Systems für CSIA untersucht, wobei L-Glutaminsäure als Modellverbindung dient. Durch Orientierungsexperimente mit direkter Infusion wurden die Auswirkungen der Auflösungseinstellungen auf die Isotopentrennung sowie der Einfluss der Flussraten und des Methanolgehalts in Probenlösungen untersucht. Anschließende Injektionsversuche gaben Aufschluss über die Herausforderungen bei der Analyse eluierender Peaks. Die Ergebnisse betonen die Notwendigkeit weiterer Untersuchungen und der Integration eines simultanen Nachweises unter Verwendung eines klassischen Sektorfeld-IRMS zu Validierungszwecken. Dies kann mithilfe der hier vorgestellten Kopplung aus LC-IRMS+HRMS erreicht werden. Im Allgemeinen bietet diese Studie wertvolle Einblicke in den Einsatz der Orbitrap-Technologie für die Weiterentwicklung der CSIA.