Anwendung von chromatographischen Trennverfahren zur Analyse von Polysacchariden in archaeellen Biofilmen von Sulfolobus acidocaldarius und anderen biologischen Materialien
Das Interesse an der Analyse von Sacchariden wächst seit einigen Jahren stetig. Sie ist für die moderne Systembiologie, die Biochemie sowie die Mikrobiologie mit ihren jeweiligen Teildisziplinen von großer Bedeutung. Darüber hinaus besitzt sie auch in den Lebensmittel- und Pflanzenwissenschaften einen hohen Stellenwert, da das Interesse an der Analyse und Identifizierung von Korrelationen bezüglich Sacchariden zunimmt. Die Analyse von Sacchariden stellt Wissenschafterinnen und Wissenschafter vor vielfältige Herausforderungen, wenn es darum geht, eine Probe, die verschiedene Formen von Mono-, Oligo- oder Polysacchariden enthält, auf ihre Zusammensetzung oder andere Eigenschaften zu untersuchen. Im Laufe der Zeit wurden viele verschiedene Analysemethoden entwickelt, optimiert und angewandt, wobei jede dieser Methoden ihre Vor- und Nachteile in Bezug auf Trennleistung, Empfindlichkeit oder Anwendbarkeit aufweist. Es ist darauf zu achten, dass jede Methode an die Anforderungen der jeweiligen Fragestellung sowie an die zu analysierende Probe angepasst wird.
Bei biologischen Proben kann der grundlegende Arbeitsablauf bei der Bestimmung der Saccharidfraktion durch fünf Schritte beschrieben werden: Er beginnt mit der Isolierung, es folgen Extraktion, Hydrolyse, Probenaufbereitung und schließlich die Analyse.
In dieser Arbeit lag der Schwerpunkt auf der Identifizierung der Monosaccharid-Zusammensetzung des Exopolysaccharids in Biofilmen des Archaeenstamms Sulfolobus acidocaldarius (S. acidocaldarius). Da bisher wenig über die Zusammensetzung und Größe von archaealen Polysacchariden bekannt ist, werden mit diesen Untersuchungen neue grundlegende Erkenntnisse gewonnen. Aus diesem Grund wurde zunächst ein Kultivierungsprotokoll optimiert, das eine möglichst hohe Ausbeute an Biofilm-Biomasse gewährleistet; dies wurde durch statische Inkubation der Archaeen auf schwimmenden modifizierten PTFE-Membranfiltern erreicht. Diese lieferten im Vergleich zu anderen getesteten Inkubationsmethoden - ob submerse Biofilme, auf festen Medien ausgestrichene Kulturen oder andere Filtermaterialien - nicht nur die höchste Masse an Biofilm im Allgemeinen, sondern auch die höchste Menge an produzierten Kohlenhydraten pro Zelle.
In einem weiteren Schritt wurde die Methodik der Saccharidanalyse untersucht. Zu diesem Zweck wurde zunächst ein Vergleich von vier verschiedenen chromatographischen Methoden wie überkritische Fluidchromatographie, hydrophile Interaktionschromatographie, Umkehrphasenflüssigkeitschromatographie und Gaschromatographie, jeweils gekoppelt an die Massenspektrometrie (MS), durchgeführt. Die Methoden wurden im Hinblick auf Trennleistung und Empfindlichkeit für eine Gruppe von 16 Monosacchariden als Bestandteile von mikrobiellen Exopolysacchariden bewertet und verglichen. Dabei hat sich gezeigt, dass die RP-LC-MS sowohl die höchste Trennleistung als auch die beste Empfindlichkeit nach Derivatisierung der Monosaccharide mit 1-Phenyl-3-methyl-5-pyrazolon (PMP) im Multiple-Reaction-Monitoring-Modus (MRM) aufweist. Mit dieser Methode konnten 15 der 16 Monosaccharide durch Basislinientrennung oder Massendifferenzen eindeutig identifiziert werden, wobei die Nachweisgrenze abhängig von der Substanz im Bereich von 10 bis 200 nmol/L lag, was einer Massenkonzentration von 1 bis 39 µg/L entspricht.
Nachdem eine geeignete Methode zur Bestimmung der Zusammensetzung von Polysacchariden (PS) gefunden wurde, wurde diese auf Proben von S. acidocaldarius Biofilmen angewandt, um einerseits die Zusammensetzung der PS unter definierten Inkubationsbedingungen zu bestimmen und andererseits in einem weiteren Schritt den Einfluss von Änderungen der Inkubationsbedingungen, hier explizit die Änderung des Wachstumssubstrats, zu untersuchen. Im PS von S. acidocaldarius Biofilmen wurden Pentosen (Ribose), Hexosen (Mannose, Glucose), Aminozucker (Galactosamin, Glucosamin), Desoxyhexosen (Rhamnose) und acetylierte Spezies (N-Acetylglucosamin) als Strukturbausteine identifiziert und quantifiziert, woraus sich das molare Verhältnis 42:35:31:6:4:1:1 ergab. Der Einfluss der Supplementierung des Nährmediums war ersichtlich, aber der Ersatz von Glukose im Nährmedium durch Xylose, Maltose oder das Fehlen von Zucker als zusätzliche Kohlenstoffquelle im Medium änderte lediglich die Konzentrationen der Monosaccharide und damit das Verhältnis, nicht aber die Anzahl oder Identität der vorhandenen Monosaccharide. In einem weiteren Schritt wurde die Größe der PS aus den Biofilmen zusätzlich durch Größenausschlusschromatographie (SEC) bestimmt. Diese ergab eine einzige PS-Fraktion mit einer für biologische Proben sehr engen Massenverteilung. Die mittlere Masse der PS-Fraktion wurde auf 71 kDa bestimmt, mit einem Minimum und einem Maximum von ~44 bzw. ~92 kDa, was basierend auf der quantifizierten Zusammensetzung durchschnittlich 460 Monosaccharidresten entspricht, wobei angenommen wird, dass eine lineare Kette vorliegt.
Schließlich wurde die entwickelte Methode auch zur Analyse der Monosaccharidprofile anderer biologischer Proben angewandt, sodass die Zusammensetzung von acht fraktionierten Kräuterlikören, zwei Pflanzenpektinen und dem menschlichen α1-sauren Glykoprotein analysiert werden konnte. Die entwickelte, optimierte und angewandte RP-LC-MS-Methode ist somit nicht nur für die Analyse von Polysacchariden aus Biofilmen, sondern auch für andere biologische Proben geeignet.
The interest in the analysis of saccharides has been growing continuously in recent years. It is highly relevant for modern system biology, biochemistry, as well as microbiology with their respective subdisciplines. Moreover, the analysis is also important in food and plant sciences as the interest in the analysis and identification of correlations regarding saccharides is growing. The analysis of saccharides confronts scientists with multiple challenges when it comes to investigating a sample containing different forms, whether it is mono-, oligo-, or polysaccharides, for their composition or other properties. Many different methods for analysis have been developed, optimized and applied over time and each of these methods offers its advantages and disadvantages in terms of separation performance, sensitivity or applicability. Care must be taken to adapt each method to the requirements of the particular issue at hand, as well as the sample to be analyzed.
For biological samples, the basic workflow in the determination of the saccharide fraction can be described by five steps: starting with the isolation and followed by extraction, hydrolysis, sample preparation and finally the analysis.
In this work, the main focus was on the identification of the monosaccharide composition of the exopolysaccharide in biofilms of the archaeal strain Sulfolobus acidocaldarius (S. acidocaldarius). So far, little is known about the composition and size of archaeal polysaccharides, thus new essential insights are achieved with these studies. Therefore, a protocol for cultivation was first optimized that would yield the highest possible amount of biofilm biomass; this was achieved by static incubation of the archaea on floating modified PTFE membrane filters. These provided the highest mass of biofilm in general, but also the highest amount of carbohydrate produced per cell, compared to other incubation methods tested, whether submerged biofilms, cultures spread on solid media, or other filter materials.
In a further step, the methodology of carbohydrate analysis was investigated. For this purpose, first a comparison of four different chromatographic methods such as supercritical fluid chromatography, hydrophilic interaction chromatography, reversed-phase liquid chromatography, and gas chromatography, each coupled to mass spectrometry (MS), was performed. The methods were evaluated and compared in terms of separation performance and sensitivity for a set of 16 monosaccharides as components of microbial exopolysaccharides. Here, RP-LC-MS has shown to have both the highest separation performance and the best sensitivity after derivatization of the monosaccharides with 1-phenyl-3-methyl-5-pyrazolone (PMP) in multiple reaction monitoring (MRM) mode. It was possible to unambiguously identify 15 of the 16 monosaccharides by baseline separation or mass differences using this method, and the detection limit, depending on the substance, ranged from 10 to 200 nmol/L, corresponding to a mass concentration of 1 to 39 µg/L.
Having found a suitable method for determining the composition of polysaccharides (PS), this was applied to samples of S. acidocaldarius biofilms in order, on the one hand, to determine the composition of PS under defined incubation conditions, and on the other hand, in a further step, to investigate the influence of changes in the incubation conditions, here explicitly the change of the growth substrate. In the PS of S. acidocaldarius biofilms, pentoses (ribose), hexoses (mannose, glucose), amino sugars (galactosamine, glucosamine), deoxyhexoses (rhamnose) and acetylated species (N‑Acetylglucosamine) were identified and quantified as structural components, resulting in the molar ratio 42:35:31:6:4:1:1. The influence of the nutrient medium supplementation was evident but replacement of glucose in the nutrient medium with xylose, maltose, or the absence of sugar as an additional carbon source in the medium changed only the concentrations of the monosaccharides and thus the ratio but not the number or identity of the monosaccharides present. In a further step, the size of the PS from the biofilms was additionally determined by size exclusion chromatography (SEC). This resulted in only one PS fraction with a very narrow mass distribution for biological samples. The mean mass of the PS fraction was determined to be 71 kDa, with minimum and maximum of ~44 and ~92 kDa, respectively, corresponding to an average of 460 monosaccharide residues assumed to be a linear chain, based on the quantified composition.
Finally, the developed method was applied to analyze the monosaccharidic profiles of other biological samples, enabling the composition analysis of eight fractionated herbal liquors, two plant pectins, and human α1-acid glycoprotein to be determined. Thus, the developed, optimized and applied RP-LC-MS method is suitable not only for the analysis of PS from biofilms but also other biological samples.