A rapid degradation approach for VCP/p97 cofactor proteins and its application in analyzing Ataxin-3 function in lysophagy
Die AAA+-ATPase VCP/p97 ist ein zentraler Bestandteil der zellulären Proteostase und verschiedener Signaltransduktionswege. Durch ATP-Hydrolyse extrahiert und entfaltet p97 eine Vielzahl von Substraten. Die Spezifität dieses Prozesses wird durch die Assoziation mit mehr als 30 Kofaktoren erreicht. Während potente Inhibitoren zur Untersuchung von p97 eingesetzt werden können, fehlten bisher akute Perturbationsmethoden zur Untersuchung der Funktionen von p97-Kofaktoren, was das Verständnis ihrer Rolle bei der p97-vermittelten Entfaltung erschwert hat. In dieser Studie wurde das dTAG-System für den akuten Proteinabbau innerhalb des p97-Kofaktorsystems entwickelt. Das System basiert auf der Fusion des Zielproteins mit der dTAG-Domäne, um seine Erkennung durch die Proteolyse-vermittelndeChimäre (PROTAC) zu ermöglichen. PROTAC rekrutiert zusätzlich eine E3-Ligase, die die Ubiquitinierung des Zielproteins und den anschließenden Abbau vermittelt. In dieser Arbeit wurden zwei repräsentative Kofaktoren – der essentielle Substratadapter Ufd1 und das deubiquitinierende Enzym Ataxin-3 – erfolgreich als Fusionsprotein mit der dTAG-Domäne generiert und es wurde gezeigt, dass sie nach der Behandlung der Zellen mit PROTAC schnell abgebaut werden. In nachfolgenden Untersuchungen wurde das dTAG-System eingesetzt, um die Rolle von Ataxin-3 in der endo-lysosomalen Schadensantwort (ELDR) zu untersuchen. Lysosomen sind zentrale degradierende Organellen. Darum hat die Permeabilisierung der lysosomalen Membran durch oxidativen Stress, lysosomotrope Medikamente oder neurotoxische Aggregate und der daraus resultierende Austritt von Protonen und Hydrolasen fatale Folgen für die Zelle. Daher hat die Zelle Gegenmaßnahmen entwickelt, um geschädigte Lysosomen entweder zu reparieren oder zu entfernen. Die Ubiquitinierung von Lysosomen spielt eine Schlüsselrolle bei der Beseitigung beschädigter Lysosomen durch Autophagie (Lysophagie genannt). Interessanterweise wurde Ataxin-3 in einem Massenspektrometrie-Screening in der Nähe beschädigter Lysosomen gefunden. In dieser Studie haben wir die Translokation von Ataxin-3 zu Lysosomen nach Schädigung bestätigt und durch PROTAC- und RNAi-vermittelte Ataxin-3-Depletion sowie ATXN3-Knockout gezeigt, dass Ataxin-3 für die Beseitigung geschädigter Lysosomen unentbehrlich ist. Ataxin-3 scheint nicht an der lysosomalen Reparatur beteiligt zu sein, da das erneute Ansäuern der Lysosomen (Reazidifizierung) in ATXN3-Knockout-Zellen nicht beeinträchtigt war. Darüber hinaus erwies sich Ataxin-3 als entbehrlich für die anfängliche Rekrutierung der Autophagie-Maschinerie. Die verbliebenen Lysosomen waren mit dem Autophagie-Rezeptor p62 bedeckt, was zeigt, dass Ataxin-3 eine Rolle bei der autophagischen Beseitigung beschädigter Lysosomen spielt; möglicherweise in späteren Stadien dieses Prozesses. Zusätzlich konnte eine direkte Verbindung zwischen fünf Kandidaten aus einem UbiquitinrestMassenspektrometrie-Screening (CCZ1, Ykt6, Vti1b, CapZα und PITPβ) und ELDR hergestellt werden durch Nachweis ihrer Translokation zu Lysosomen nach Schädigung. Zusammenfassend wurde ein wertvolles Werkzeug für den schnellen Proteinabbau von p97-Kofaktoren geschaffen, das bei der weiteren Erforschung des p97-Systems hilfreich sein wird. Darüber hinaus wurde Ataxin-3 als Regulator der Lysophagie und fünf neue ELDR-Faktoren identifiziert, was zum Verständnis der molekularen Mechanismen während ELDR beiträgt.
The AAA+-ATPase VCP/p97 is a central player in cellular proteostasis and various signaling pathways. Via ATP hydrolysis, p97 extracts and unfolds a diverse sub-set of substrates. Specificity is achieved through association with more than 30 cofactors. While potent inhibitors can be used to study p97, acute perturbation methods for investigating the functions of its cofactors have been lacking, which has impeded the understanding of their roles in p97-mediated unfolding. In this study, we established the dTAG system for acute protein degradation within the p97 system. The system involves the fusion of the target protein with the dTAG domain to enable its recognition by the proteolysis-targeting chimera (PROTAC). The PROTAC additionally recruits an E3 ligase, facilitating target ubiquitination and subsequent degradation. We successfully tagged two representative cofactors – the essential substrate adapter Ufd1 and the deubiquitinating enzyme Ataxin-3 – with the dTAG domain and demonstrated their rapid degradation upon PROTAC treatment. Subsequent work applied the dTAG system to investigate the role of Ataxin-3 in the endo-lysosomal damage response (ELDR). Lysosomes are central degradative organelles. Thus, permeabilization of the lysosomal membrane by oxidative stress, lysosomotropic drugs, or neurotoxic aggregates and the resulting leakage of protons and hydrolases has fatal consequences for the cell. Therefore, the cell has developed countermeasures to either repair or remove damaged lysosomes. Here, lysosomal ubiquitination plays a key role in the clearance of damaged lysosomes by autophagy (termed lysophagy). Interestingly, we previously found Ataxin-3 in the vicinity of damaged lysosomes in a mass spectrometry screen. In this study, we confirmed the translocation of Ataxin-3 to lysosomes upon damage and demonstrated that Ataxin-3 is essential for the clearance of damaged lysosomes by PROTAC and RNAi-mediated Ataxin-3 depletion as well as ATXN3 knockout. Ataxin-3 does not seem to be involved in lysosomal repair, since re-acidification was unaffected in ATXN3 knockout cells. Additionally, Ataxin-3 proved to be dispensable for the initial recruitment of the autophagic machinery. However, the persisting lysosomes were covered with the autophagy receptor p62 showing that Ataxin-3 plays a role of in the autophagic clearance of damaged lysosomes possibly at later stages of this process. Moreover, we were able to establish a direct link of five candidates from a ubiquitin remnant mass spectrometry screen (CCZ1, Ykt6, Vti1b, CapZα, and PITPβ) to ELDR by demonstrating their translocation to lysosomes upon damage. In summary, we established a valuable tool for rapid protein degradation of p97 cofactors which will aid in further research of the p97 system. Additionally, we identified Ataxin-3 as a regulator of lysophagy and five novel ELDR factors, which contributes to the understanding of the molecular mechanisms during ELDR.