Genomic and phenotypic heterogeneity of malignant tumors and their microenvironment
The advance of next-generation sequencing approaches facilitates the exploration of molecular characteristics across cancer genomes, transcriptomes, methylomes, and many other levels. The increasing number of sequenced tumor samples reveals the molecular heterogeneity between patients, primary and metastatic lesions and cells as well as molecular mechanisms associated with metastatic dissemination or treatment resistance. These potentially can influence tumor progression and therapeutic intervention.
The first part of this thesis investigates the genomic landscape of Merkel cell carcinoma (MCC) cell lines. MCC is a rare and aggressive neuroendocrine skin cancer associated either with ultraviolet (UV)-light induced DNA damage or clonal integration of the Merkel cell polyomavirus (MCPyV). The associated genomic variations are well studied in tumor tissue, but not in MCC cell lines that are frequently used as preclinical models. Therefore, I analyzed whole-exome sequencing data of 3 UV- and 6 MCPyV-associated MCC cell lines demonstrating that their mutational landscape is congruent with MCC tumor tissue. UV-associated cell lines have a high tumor mutational burden (TMB), single-base substitution signatures (SBS) reflecting UV-light induced DNA damage, pathogenic variants in TP53 and RB1 genes and a high number of copy number variations (CNVs). In contrast, MCPyV-associated cell lines show only few mutations with no specific signature, but characteristic CNVs. We further found additional genomic heterogeneity with an amplified and overexpressed c-MYC in the UV-associated cell line UM-MCC34, indicating the presence of potential further MCC subtypes.
The second part of this thesis analyzes the transcriptomic and cellular heterogeneity of oral cavity squamous cell carcinoma (OSCC). OSCC is caused by an abuse of tobacco- and alcohol consumption and frequently develops locoregional lymph node metastases. The metastatic spread is often mediated by epithelial-mesenchymal transition (EMT), in which cells change from a more adherent towards a migratory phenotype, and the reverse process of mesenchymal-epithelial transition (MET). Hence, I analyzed single cell mRNA sequencing (scRNAseq) data of 14 primary tumors, 9 metastatic and 5 tumor-free lymph nodes of in total 16 OSCC patients. First, the analysis focused on one metastatic lymph node from which the malignant cell phenotypes and their developmental relationship are inferred. Besides a partial EMT state, we found another intermediate state possibly resembling a partial MET. This state characterizes a progressive epithelial differentiation marked by higher expression of the keratinocyte-envelope protein cornifin B, increasing number of CNVs and high activity of the EMT-inducing transcription factor ZEB1. This population was also validated in the other malignant samples using scRNAseq data and by detecting co-expressed ZEB1 and cornifin B protein. Additionally, we could link variations in partial EMT phenotypes with tumor-promoting properties such as angiogenesis and investigated the tumor microenvironment (TME) utilizing scRNAseq and additional bulk transcriptomic data. The TME of OSCC is mainly composed of fibroblasts and their subtypes, most prominently an immunomodulatory phenotype, that were similarly found in primary and metastatic lesions. In summary, the second part revealed the complexity of the epithelial-mesenchymal plasticity that includes additional intermediate manifestations linked with ZEB1 and cornifin B expression. This indicates a role of ZEB1 beyond EMT-induction that could be associated with epithelial differentiation.
The results of this thesis add insights into the genomic and transcriptomic heterogeneity in cancer, which could be important for metastatic disease and malignant progression. The identified phenotypes may provide the basis for generating molecular markers with predictive or prognostic relevance supporting future therapy decision making.Durch den Fortschritt in der next-generation-Sequenzierung ist es möglich, die molekularen Charakteristika von Krebserkrankungen in Genomen, Transkriptomen, Methylomen und vielen anderen Ebenen zu erforschen. Die steigende Anzahl an sequenzierten Tumoren offenbart die molekulare Heterogenität zwischen erkrankten Personen, primären und metastatischen Läsionen und einzelnen Zellen sowie die molekularen Mechanismen, die mit Metastasierung oder Therapieresistenzen assoziiert sind. Diese können großen Einfluss auf die weitere Entwicklung des Tumors und den therapeutischen Erfolg haben.
Der erste Teil dieser Dissertation untersucht die genomische Vielfalt von Merkelzellkarzinom (MZK)-Zelllinien. Das MZK ist ein seltener, aggressiver und neuroendokriner Hauttumor, der entweder mit DNS-Schäden durch Ultraviolettes (UV)-Licht oder der klonalen Integration des Merkelzellpolyomavirus (MZPyV) einhergeht. Die damit verbundenen genomischen Veränderungen sind im Tumorgewebe gut erforscht, aber nicht in oft als präklinische Modelle genutzten Zelllinien. Deswegen habe ich whole-exome-Sequenzdaten von 3 UV- und 6 MZPyV-assoziierten MZK-Zelllinien untersucht, die zeigen, dass die Mutationslandschaft von MZK-Zelllinien denen von Tumorgeweben entspricht. UV-assoziierte Zelllinien haben eine hohe Mutationslast, Signaturen von Einzelnukleotidveränderungen, die den durch UV-Licht verursachten DNS-Schaden widerspiegeln, pathogene Varianten in den Genen TP53 und RB1 und eine hohe Anzahl an Kopienzahlveränderungen (KZV). Im Gegensatz dazu haben MZPyV-assoziierte Zelllinien nur wenige Mutationen ohne spezifische Signatur, aber mit charakteristischen KZV. Wir fanden außerdem weitere genomische Heterogenität zwischen den MZK-Zelllinien, die auf die Existenz weiterer MZK Subtypen hinweist: Das c-MYC Gen ist in der UV-assoziierten Zelllinie UM-MCC34 amplifiziert und überexprimiert.
Der zweite Teil dieser Doktorarbeit untersucht die transkriptomische und zelluläre Heterogenität von oralen Plattenepithelkarzinomen (oPEK). oPEK werden durch exzessives Rauchen oder Alkoholmissbrauch verursacht und entwickeln häufig lokoregionäre Lymphknotenmetastasen. Die Metastasierung ist dabei oft durch die Epithelial-Mesenchymale Transition (EMT) getrieben, in den Zellen von einem mehr adhärenten zu einem migratorischen Phänotyp wechseln, und dem umgekehrten Prozess der Mesenchymal-Epithelialen Transition (MET). Daher habe ich single-cell mRNS-Sequenzierungsdaten (scRNSseq) von 14 Primärtumoren, 9 metastasierten und 5 tumorfreien Lymphknoten in insgesamt 16 oPEK-Patient:innen analysiert. Zuerst hat sich die Analyse auf einen metastasierten Lymphknoten und die dort enthaltenen malignen Zellphänotypen sowie deren evolutionäre Zusammenhänge fokussiert. Neben einem partiellen EMT-Zustand haben wir außerdem einen anderen, intermediären Zustand entdeckt, der auf eine partielle MET hindeutet. Dieser Zustand ist charakterisiert durch eine progressive, epitheliale Differenzierung, gekennzeichnet durch höhere Expression des Keratinozyt-Hüllprotein Cornifin B, steigende Anzahl an KZV und hohe Aktivität des EMT-induzierenden Transkriptionsfaktors ZEB1. Diese Zellen wurden ebenso in anderen Proben gefunden, darunter in den scRNS Datensätzen und mittels Immunhistochemie als Koexpression von ZEB1 und Cornifin B Protein. Des Weiteren konnten wir Variationen im partiellen EMT-Phänotyp mit tumorfördernden Eigenschaften, wie zum Beispiel der Angiogenese, verlinken sowie die Tumor Mikroumgebung (TMU) mithilfe von scRNSseq und konventionellen RNS-Daten untersuchen. Diese haben gezeigt, dass die TMU von oPEK hauptsächlich aus Fibroblasten und deren Subtypen besteht, wovon Immunmodulierende Fibroblasten am meisten präsent sind und die sowohl in Primärtumoren als auch in Metastasen vorkommen. Zusammenfassend zeigt der zweite Teil die Komplexität der Epithelial-Mesenchymalen Plastizität, die weitere intermediäre Ausprägungen assoziiert mit ZEB1 und Cornifin B Expression inkludiert. Damit deutet diese Arbeit auch auf eine weitergehende Rolle von ZEB1 hin, die über die EMT-Induktion hinausgeht und mit epithelialer Differenzierung verbunden sein könnte.
Die Resultate dieser Dissertation haben weitere Erkenntnisse über die genomische und transkriptomische Heterogenität in Krebserkrankungen hervorgebracht, die potenziell wichtig für die Metastasierung und weitere Tumorentwicklung sein könnten. Die identifizierten Phänotypen könnten als Basis für die Entwicklung von molekularen Markern dienen, die eine prädiktive oder prognostische Relevanz haben und zukünftige Therapieentscheidungen unterstützen könnten.